Pomen retroelementov v mikrobnih genomih

Uvod

Retroelementi so genetski elementi, ki vsebujejo zapis za reverzno transkriptazo. Delujejo na način 'kopiraj in prilepi', tako da se najprej prepišejo v intermediarno RNA, se nato reverzno prepišejo v cDNA ter vstavijo na neko novo mesto v genomu. Reverzna transkriptaza je bila najprej odkrita 1970 v virusu sarkoma Rous ter virusu mišje levkemije, slabih 20 let kasneje pa so jo našli tudi v prokariontih kot ključno komponento retronov. Retroelemente, ki kodirajo reverzne transkriptaze v glavnem uvrščamo v tri večje skupine – introni skupine II, DGR (angl. diversity-generating retroelements) in retroni. Od teh imajo samo introni skupine II ohranjeno avtonomno mobilnost, zato sklepajo, da so se ostale oblike retroelementov razvile iz njih. Za DGR-je in retrone je značilno, da prinašajo neko selektivno prednost bakterijam, arhejam ali virusom. Zaradi te ugodne lastnosti jih lahko najdemo v širokem spektru mikroorganizmov in habitatov. Znotraj vsakega razreda retroelementov so se razvile nekatere univerzalne značilnosti, skupne različnim taksonomskim razredom, medtem ko specifične funkcijske in mehanistične lastnosti teh elementov temeljijo le na nekaj modelnih sistemih kliničnih izolatov. Malo pa je trenutno znanega o njihovi celični funkciji in ekološkem pomenu znotraj različnih biomov.

Introni skupine II

Introni skupine II so bili prvič opisani v mitohondrijskem in kloroplastnem genomu nižjih evkariontov in rastlin. Leta 1993 pa so jih odkrili tudi pri prokariontih in veljajo za prototipne retroelemente bakterij, saj so najbolj pogosti in tudi najbolje opisani. Zgrajeni so iz 500-800 bp dolgega zaporedja, ki kodira RNA strukturo oziroma ribocim, in 1,0-1,5 kb dolgega zaporedja ORF, ki ima zakodiran protein IEP (angl. intron-encoded protein). IEP je reverzna transkriptaza, ki vsebuje 7 ohranjenih zaporednih blokov oziroma motivov, poleg tega IEP vsebuje tudi X domeno. Ta je strukturno analogna polimerazni domeni palca. Navzdol po zaporedju je zakodirana tudi DNA-vezavna domena in včasih tudi endonukleazna (En) domena.

Mehanizem retrohominga oz. reintegracije introna v DNA

Intron se najprej prepiše skupaj z eksoni v prekurzorsko mRNA in ta se zloži v tridimenzionalno strukturo, ki katalizira izrezovanje. V in vivo pogojih se mora najprej prevesti protein IEP in se vezati na intronsko RNA, da tako pripomore k zvijanju intronske RNA v katalitično konformacijo ter spajanju eksonov. Po izrezovanju ostane IEP vezan in tvori se stabilni ribonukleoproteinski (RNP) delec, ki ga sestavljata reverzna transkriptaza in intronski lariat RNA. RNP delec nato vstavi intronsko zaporedje na nek nov genomski predel. To stori tako, da se RNP veže na dvojno vijačnico DNA, intronski lariat se reverzno vstavi na zgornjo verigo, En domena proteina IEP pa cepi spodnjo verigo in predstavlja primer, ki se reverzno prepiše s pomočjo reverzne transkriptaze. S pomočjo mehanizmov za celično popravljanje napak na DNA lahko celica tvori novonastalo dvojno vijačnico v kateri je vstavljen novi intron. Pomembna karakteristika intronov skupine II je, da se primarno obnašajo kot retroelementi in ne kot introni. Introni so namreč v splošnem izključeni iz hišnih (angl. housekeeping) in ohranjenih genov. Prav tako je več kot polovica kopij intronov okrnjenih in nefunkcionalnih. Introni skupine II se v vsem tem razlikujejo.

DGR (angl. diversity-generating retroelements)

DGR-ji so navadno sestavljeni iz več komponent – gena za reverzno transkriptazo (RT), od 100 do 150 bp dolgega TR (angl. template repeat) gena, tarčnega gena, ki se končuje z variabilno regijo (VR). Ta je do 90 % identična TR zaporedju. Ponavadi pa vsebuje tudi aksesorni gen avd (angl. accessory variability determinant).

DGR na splošno zaznavajo z bioinformatskimi metodami. Najprej poiščejo gen za reverzno transkrpitazo, potem pa v bližini tega gena iščejo za DGR specifične ponovitve. Pri iskanju lahko uporabijo še druge kriterije, npr. homologija znanih DGR. DGR najdemo pri velikem številu prokariontov, kar 80 % znanih DGR je prisotnih v deblih Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria in Bacteroidetes, našli pa so jih tudi v deblih Actinobacteria, Chlorobi, Deinococcus in Spirochaetes in v arhejah. Raziskave so izvedene samo na znanih genomih, stanje v naravi pa je lahko precej drugačno (podatkovna zbirka GenBank, ki se velikokrat uporablja kot vir podatkov, vsebuje gene 10 % vseh opisanih vrst). DGR se najpogosteje nahaja na kromosomu, pojavlja pa se tudi na prostih fagih in plazmidih. Ob upoštevanju sekvenc iz metagenoma je na kromosomu zapisanih približno 90 % DGR. Pri določanju DGR na kromosomu se pojavi težava, ali je zaporedje res del kromosoma ali pa je povezano s fagom (je kot profag vezan v kromosom). To je posledica dejstva, da fagi nimajo specifičnih konservativnih genov, v genomu pa se nahajajo tudi neaktivni fagni ostanki. Kadar ugotovimo, da je v genom vključen fag pa je težko določiti mejo, do kje sega in ali je DGR torej še del fagnega genoma. Običajno se smatra, da je gen znotraj faga, če na obeh straneh gena najdemo fagu homologno zaporedje.

Filogenija in evolucija

Čeprav ne moremo predvidevati, da filogenija RT natančno predstavlja evolucijo celotnih DGR elementov, je RT edina komponenta, ki jo lahko poravnamo iz vseh DGR. Nekatere veje imajo dobro podporo, vseeno pa je resolucija za drevo gledano v celoti slaba. Posledično ne moremo uvrstiti vseh RT v definirane skupine. Obstaja pa dobra povezava med drevesom RT in glavnimi lastnostmi DGR, kar podpira idejo, da se geni DGR razvijajo skupaj - kot celota (usklajeni so razredi VR, domene tarčnih proteinov, prisotnost pomožnih genov...). DGR se prenašajo horizontalno in vertikalno. Dokaz za horizontalni prenos je raztreseno pojavljanje DGR v različnih sevih vrste, atipična vsebnost GC parov, obstoj skoraj identičnih DGR v različnih vrstah in razlike med filogenijo RT in filogenijo vrst. Obstajajo tudi dokazi o vertikalnem prenosu genov, saj so nekateri DGR prisotni predvsem v isti ali sorodnih vrstah.

Primer sistema DGR pri bakteriofagu BPP-1

Bakteriofag BPP-1 napada bakterije iz rodu Bordetella. DGR iz tega virusa predstavlja prototipski DGR in omogoča fagni tropizem s spreminjanjem gena mtd, ki kodira receptor s prepoznavno funkcijo. Hiperspremenljivost zaporedja se pojavi zaradi enosmernega transpozicijskega procesa (mutagenic homing). Za ta proces so potrebni TR RNA intermediat, protein Avd (accessory variability determinant) in reverzna transkriptaza (RT). Smer BPP-1 hominga je nadzorovana preko tarčnega (VR) zaporedja, zaporedja IMH (initiation of mutagenic homing) in zankaste DNA. Tarčno prepoznavanje na 5' koncu VR je določeno s homologijo s TR. Pri mutagenem homingu najprej nastane transkript TR RNA, ki ga cepi RT ob sodelovanju Avd kot kofaktorja. Nastala prosta OH skupina na 3' potem služi kot začetni oligonukleotid za RT, ki reverzno prepiše TR, pri tem pa napravi veliko napak (predvsem se napake pojavljajo na mestih, kjer je na TR prisoten adenin). Kako potem cDNA interagira z VR, ni znano. Predvidevajo, da DNA zanka omogoča prehodno odvitje DNA, da se hibridna molekula RNA-cDNA lahko vrine. Poteče homologna rekombinacija in na ta način dobimo spremenjen gen.

Retroni

Retroni so okrog 2 kbp dolga DNA zaporedja, ki jih pogosto najdemo znotraj profagnih regij genoma številnih vrst bakterij. Gre za dele bakteriofagne DNA, ki se je z insercijo vstavila v bakterijski kromosom. Retroni vsebujejo gen imenovan ret, ki kodira posebno vrsto reverzne transkriptaze (RT), in regiji imenovani msr in msd, ki predstavljata nekodirajočo RNA (ncRNA). Da RT lahko prepozna matrico, mora biti transkript ncRNA zvit v specifično sekundarno strukturo, ki nastane s tvorbo vodikovih vezi med dvema obrnjenima ponovitvama na 5’ in 3’ koncih, ter tvori t.i. steblo oz. dvoverižno RNA. To povzroči, da se izpostavi gvanozinski ostanek znotraj ohranjenega zaporedja AGC v regiji msr (imenovan tudi razvejitveni G), čigar 2’-OH skupina služi kot začetek za sintezo cDNA. Po vzpostavitvi 2’-5’ fosfodiestrske vezi s prvim deoksiribonukleotidom, RT nadaljuje sintezo cDNA, hkrati pa znotrajcelična RNaza H razgrajuje verigo msd, ki je služila kot matrica. Nastali RNA-DNA hibrid, imenovan tudi večkopijska enoverižna DNA (msDNA), sestavlja torej veriga RNA (msr), kovalentno povezana z reverznim transkriptom DNA (msd). Ker se msDNA ne more avtonomno replicirati, retron pravzaprav predstavlja operon, potreben za njeno sintezo.

Funkcija retronov pri obrambi pred bakteriofagi

Funkcija retronov vse od njihovega odkritja leta 1984 dolgo časa ni bila poznana, šele raziskave v zadnjih nekaj letih so pokazale, da naj bi skupaj z efektorskimi proteini delovali kot anti-fagni obrambni sistemi. Ugotovljeno je bilo, da se okrog 40 % do sedaj znanih retronov iz bakterijskih in arhejskih genomov nahaja v t.i. obrambnih otokih genoma, poleg genov, ki so udeleženi pri obrambi celice pred napadom bakteriofagov. Te, z retroni povezane gene, imenujemo retronski ‘efektorji’.

Abortivna infekcija

Retron Ec48 iz bakterije E.coli (številka v imenu se nanaša na dolžino reverzno-prepisanega DNA segmenta) se nahaja v bližini gena, ki kodira protein z domeno 2TM z dvema transmembranskima vijačnicama. Take domene so pogoste pri efektorskih proteinih, ki vplivajo na zmanjšanje integritete in povečanje permeabilnosti membrane, kar povzroči smrt okužene bakterije, še preden lahko bakteriofag zaključi svoj razmnoževalni cikel in se prenese na preostalo populacijo (sprožijo abortivno infekcijo). Kompleks RecBCD predstavlja imunski center bakterijske celice, zato imajo številni bakteriofagi v svojem genskem zapisu zakodirane proteine, ki inhibirajo ta encim. RecBCD ima ključno vlogo pri popravljanju DNA, zaradi svoje nukleazne aktivnosti pa je sposoben tudi hitre razgradnje linearne dvoverižne bakteriofagne DNA. Sestavljajo ga tri podenote; spremembe v strukturi podenote RecB, kot posledica delovanja fagnih inhibitorjev, dokazano aktivirajo retron obrambni sistem Ec48. Predvideva se, da se retronska msDNA veže na domeno RecB, ob okužbi celice pa jo izpodrine fagni inhibitor. Ko je msDNA prosta, lahko aktivira efektorski protein. Točen mehanizem, preko katerega ta RNA-DNA hibridna molekula prepozna domeno RecB oz. fagne proteine, še ni poznan, prav tako ne mehanizem, preko katerega se signal nato prenese do efektorskega proteina, ki sproži celično smrt.

Sistem toksin-antitoksin

V primeru retrona St85 iz bakterije Salmonella Typhimurium retronska msDNA skupaj z RT direktno interagira z efektorskim proteinom in kontrolira njegovo aktivnost, torej deluje kot trodelni sistem toksin-antitoksin. Kompleks RT-msDNA predstavlja antitoksin, pri čemer je RT potrebna za specifičnost interakcije, saj veže bakterijski toksin RcaT (Retron cold-anaerobic Toxin), msDNA pa omogoča antitoksinsko aktivnost oz. njegovo inhibicijo. Če fagni proteini degradirajo oz. razcepijo msDNA, to inaktivira antitoksin in povzroči aktivacijo RcaT, ki inhibira rast te bakterije. Zakaj do inhibicije rasti pride le v hladnih in anaerobnih pogojih, še ni jasno.

Viri

1. Millman A, Bernheim A, Stokar-Avihail A, Fedorenko T, Voichek M, Leavitt A, et al. Bacterial Retrons Function In Anti-Phage Defense. Cell. 2020;183: 1551-1561.e12. doi:10.1016/j.cell.2020.09.065

2. Paul BG, Eren AM. Eco-evolutionary significance of domesticated retroelements in microbial genomes. Mob DNA. 2022;13: 6. doi:10.1186/s13100-022-00262-6

3. Wu L, Gingery M, Abebe M, Arambula D, Czornyj E, Handa S, et al. Diversity-generating retroelements: natural variation, classification and evolution inferred from a large-scale genomic survey. Nucleic Acids Research. 2018;46: 11–24. doi:10.1093/nar/gkx1150

4. Naorem SS, Han J, Wang S, Lee WR, Heng X, Miller JF, et al. DGR mutagenic transposition occurs via hypermutagenic reverse transcription primed by nicked template RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114. doi:10.1073/pnas.1715952114

5. Zimmerly S, Wu L. An Unexplored Diversity of Reverse Transcriptases in Bacteria. Microbiol Spectr. 2015;3: MDNA3-0058–2014. doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0058-2014