AngelRoots

Problem

Izpadanje las pri kemoterapiji je pojav, ki se pojavi pri več kot 60 % bolnikov. CIA (alopecija povezana s kemoterapijo) pomembno vpliva na keratinocite lasnega matriksa, saj povzroči, da lasni mešiček vstopi v telogeno fazo mirovanja iz katere ne preide več v fazo rasti. Vizija projekta je bila narediti Angel Roots gotov izdelek, ki bo rešitev za paciente udeležene kemoterapije, ter spodbujati prihodnje raziskave povezane z dekurzinom in njegovimi učinki. Dekurzin je piranokumarin, pridobljen iz rastline Angelica gigas, zdravilne rastline, ki se pogosto uporablja v Aziji. Študije so pokazale, da ima dekurzin velik medicinski pomen, zlasti za zdravljenje CIA. Rastlina Angelica gigas je zelo redka rastlina, dekurzin pa predstavlja le 3,7% mase korena. Zato je ekstrakcija iz korena draga in zahtevna, ob tem pa tudi onesnažujoča za okolje.

Načrt dela

Skupina iz Izraela je projekt zasnovala tako, da so uporabili bakterijske celice (Escherichia coli BL21 DE3) za bioproizvodnjo dekurzina. V prihodnosti bi bakterije bile optimizirane tako, da bi proizvajale dekurzin v velikem obsegu, ta bi se nato dodajal v šampone in losijone za zdravljenje CIA. Odločili so se za oblikovanje dveh vektorjev, ki kodirata tri encime potrebne za katalizo dveh predzadnjih reakciji v anabolični poti sinteze dekurzina. V njihovem sistemu je peti metabolit poti, umbeliferon (UMB), podvržen prenilaciji, da nastane 7-demetilsuberozin (DMS). Reakcijo katalizira encim umbeliferon 6-preniltransferaza (U6PT). Od tam reakcija ciklizacije povzroči, da iz DMS nastane dekurzinol. Zadnja reakcija, kjer iz dekurzinola nastane dekurzin je neencimska intramolekularna reakcija esterifikacije na položaju C-3 dekurzinola. Sistem je bil zasnovan tako, da UMB prehaja bakterijsko membrano s pasivno difuzijo. Po transformaciji bakterijskih celic s konstruiranima vektorjema, bi prišlo do fermentacije in proizvodnje encimov potrebnih za nastanek želenega produkta dekurzina, ki se po lizi celic sprosti v medij. Ob proizvodnji dekurzina s pomočjo bakterij, skupina se je osredotočala tudi na računalniške metode za izboljšanje strukture encimov ter na teste kvantifikacije proizvedenega dekurzina (OraCell) in teste učinkovitosti dekurzina na koži podobnih materialih (test PAMPA).

Potek dela

Sinteza vektorjev preniltransferaz (PT)

Preniltransferaze (PT) so razred encimov, ki posredujejo reakcije prenilacije, pri katerih se izoprenoidni del, prenese iz donorske molekule na akceptorsko. Ekipa se je odločila za izdelavo vektorjev štirih homolognih encimov: Preniltransferaza Petroselium crispum (PcPT) iz listov peteršilja, P. sativa preniltransferaza 1 (PsPT1), F. carica prenil transgeraza 1 (FcPT1) in Umbeliferon preniltransferaza (UDT) iz genoma Glehnia littoralis. Dodatno so sintetetizirali vektorje dveh himernih encimov. PT1a-Citrus limon se je uspešno izražala v kvasovkah, zato so jo tudi poskusili izraziti v bakterijah. Glede na to, da je želena reakcija prenilacija umbeliferona na položaju C6 z uporabo DMAPP kot prenilnega donorja, ta encim v tem primeru uporabi le želeni akceptor, ne pa tudi donorja. Našli so dva encima, G4DT in PT1L iz soje in hmelja, izraženih v kvasovkah, ki uporabljata ustrezen donor. S kombinacijo identificiranih mest so ustvarili dva himerna encima: encim PT1a - Citrus limon z donorskim vezavnim mestom iz PT1L ter encim PT1a - Citrus limon z donorskim vezavnim mestom iz G4DT. Vse encime so izražali pod rhlR promotorjem. Dodali so tudi zaporedje P2A, samocepljivi peptidni element, ki inducira preskakovanje ribosomov med prevajanjem proteina v celici, do reporterskega gena mCherry. Vsi U6PT vsebujejo od 6 do 9 transmembranskih vijačnic in imajo tranzitno peptidno sekvenco (TP) na svojem N-terminalnem koncu. Ekspresija šestih rastlinskih PT v sistemih kvasovk brez zaporedja TP (skrajšana oblika - ΔTP-U6PT) poveča učinkovitost njihove ekspresije in tako daje boljše rezultate.

Sinteza vektorja za XimD in XimD

Encim XimD je skupaj z encimom XimE odgovoren za pretvorbo 7-demetilsuberozina (DMS) v dekurzinol. XimD je od flavina odvisna monooksigenaza, ki deluje pri oksidaciji DMS, da nastane epoksidni intermediat. Ob prisotnosti encima XimE, ki je SnoaL podobna ciklaza, se ta intermediat podvrže ciklizaciji, da nastane dekurzinol. Geni obeh teh encimov so klonirani v en plazmid, kjer je XimD bil reguliran s sistemom Lac, XimE pa s Tet-On. Tako so nadzorovali ekspresijsko razmerje med obema encimoma Xim. XimE je bilo potrebno izraziti konstitutivno, da je prišlo do povečane biološke proizvodnje želenega produkta - dekurzinola. Bakterijske celice (E. coli BL21 DE3) so transformirali z zgoraj omenjenima vektorjema. Ta specifičen sev je bil izbran zaradi njegove sposobnosti izražanja T7 polimeraze. Vsak plazmid ima drugačno mesto začetka replikacije in odpornost na antibiotike, kar zagotavlja ohranitev obeh plazmidov po selekciji.

Računalniške metode

Usmerjena mutageneza je pomembno orodje za izboljšanje lastnosti proteinov in afinitete med encimi in njihovimi substrati. Z uporabo računalniških orodij je mogoče raziskati široko paleto mutacij, kar zmanjša čas, delo in laboratorijsko opremo. S pomočjo CB-Dock2 analize encima XimE so lahko izbrali aminokisline vključene v vezavo epoksidiranega 7-demetilsuberozina. Po pregledu literature so se odločili za tri aminokislinska ostanka - E136, Y153 in H102, ki jih literatura največkrat navaja in ki ne vplivajo na aktivnost encima. Po ciljanju na tri aminokisline encima XimE, je ekipa pridobila različne rezultate, pri čemer se je H102P pokazala kot najbolj obetavna mutacija. Razlog bi lahko bil v prolinu, ki je znan po tem, da stabilizira terciarne strukture proteinov.

OraCell - biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo dekurzina

Med raziskovanjem dekurzina so odkrili, da poleg tega, da je vodilni kandidat pri zdravljenju CIA, bistveno pomaga pri zaviranju rasti tumorja preko signalne poti Hippo. Na tej poti se proteini Yap/Taz translocirajo v jedro celic sesalcev, se vežejo na transkripcijski faktor TEAD, ta pa se veže na specifičen motiv DNA ter inducira in regulira transkripcijo genov. V prisotnosti dekurzina so zgornji proteini fosforilirani, kar povzroči razgradnjo Yap/Taz proteinov in posledično zmanjša transkripcijo. Najsodobnejša metoda, ki se uporablja za kvantifikacijo je tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC), vendar HPLC je naprava z nizko pretočnostjo, vsak postopek je dolgotrajen, delo pa zahteva posebno strokovno znanje. Ob tem je sama naprava HPLC zelo draga in ni široko dostopna. Po odkritju, da dekurzin vpliva na signalno pot Hippo, skupina je načrtovala vključitev te poti v metodo za kvantificiranje in določanje dekurzina, ki so jo poimenovali OraCell. Sistem OraCell temelji na obstoječem plazmidu z reporterskim genom luciferaze, za odzivnimi elementi TEAD. Odločili so se plazmid integrirati v genom ovarijskih celic kitajskega hrčka CHO. V plazmid Blast_Luc_OraCell so s kloniranjem dodali osem GTIIC motivov z visoko afiniteto za specifične transkripcijske faktorje, ki povzročijo znižanje ekspresije gena za luciferazo ob prisotnosti dekurzina. Dodali so tudi selekcijski marker (BlastR), ki daje odpornost proti blasticidinu, toksinu celic sesalcev. 24 ur po transfekciji s plazmidom so sesalske celice gojili v selektivnem mediju, da so te plazmid integrirale v svoj genom. Transfekcija povzroči konstitutivno izražanje reporterskega gena za luciferazo. Pri dodajanju bakterijsko proizvedenega dekurzina in luciferina, se prepreči vezava transkripcijskega faktorja TEAD na DNA, kar povzroči zmanjšanje bioluminiscenčnega signala.

Testi učinkovitosti in aplikacije dekurzina

Del projekta je vključeval merjenje učinkovitosti in aplikacije dekurzina s testom Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA). Ta test je brezcelična, varna, poceni in visokozmogljiva metoda, ki posnema pasivno difuzijo skozi glavno oviro za prehajanje skozi lasišče, stratum corneum. Glede na to, da so načrtovali dodajanje dekurzina v šampone, jih je zanimalo ali bo ta prehajal v lasišče. Še bolj pomembna je bila potreba po preverjanju, ali je prepustnost dekurzina morebitno previsoka. Dekurzin vpliva na celično proliferacijo prek različnih mehanizmov in če prodre pregloboko v kožo, bi se lahko začel kopičiti v telesu in bi prišlo do sistemskega širjenja škodljivega za organizem. Test PAMPA je bil zasnovan tako, da sta dve vdolbinici ločeni z membrano, ki predstavlja kožno pregrado. V eno vdolbinico so dodali dekurzin in inkubirali 18 ur. Po inkubaciji so izmerili absorbanco pri valovni dolžini 330 nm. Absorbanca je bila pretvorjena v prepustnost z uporabo enačbe, ki je bila priložena k kompletu reagentov. Absorbance kontrol, ki so bile nanešene v drugo vdolbinico: metil paraben, propil paraben in teofilin, so bile izmerjene po 18-ih urah inkubacije pri valovni dolžini 260, 260 in 270 nm. Metil paraben, propil paraben in teofilin delujejo kot predstavniki visoke, srednje ter nizke prepustnosti. Rezultati testa so pokazali, da je dekurzin nizkoprepusten. To nakazuje, da bi lahko bil varen za uporabo v formulaciji, ki se dotika kože. Prepustnost je pa dovolj visoka, da prodre do zahtevane globine 4,16 milimetrov pri 10 nanomolarni koncentraciji.

Cilji za prihodnost

V praksi bo množična proizvodnja dekurzina zahtevala obsežne bioreaktorje in ustrezne parametre za zagotavljanje optimalnih pogojev za rast bakterij. Končni projekt bo dostopen kot dnevni izdelek, v vidu šampona ali kreme, ki bi se naj prilagodil pacientu v enostavni obliki s preprostim nanosom. Bioproizvodnja je tvegana, saj lahko bakterijski materiali ustvarijo imunski odziv. Zato bi skupina iz Izraela definirala postopek ekstrakcije, pri katerem ločijo bakterije od gojišča in s kloroformom očistijo metabolit. Pot do odobritve kozmetičnega izdelka je dolga in zahtevna, saj bodo v prihodnosti mogli dokazati učinkovitost in varnost dekurzina z dermatološkimi testi ter zagotoviti njegovo čistost. V prihodnosti nameravajo ustanoviti podjetje Angel Roots, ki ga bodo sestavljali: ekipa za raziskave in razvoj - za nadaljnje raziskave, razvoj in izboljšave, ekipa bioinženirjev, ki bo upravljala z biofermentorji, ekipa farmacevtov zadolžena za formulacijo in na koncu tudi tržna ekipa, ki bo povezovala izdelek z uporabniki.