Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga

Relaksazna funkcija MobM

MobM je dimer iz 494 amonokislinskih ostankov, ki ima veliko vsebnost Glu in Asp. Glavni domeni sta povezani s kratko a-helikalno verigo, ki je ključna za pravilno pozicijoniranje DNA v katalitičnem mestu (brez nje encim ni funkcionalen). Celotna struktura relaksaze je podobna levi dlani, kjer osrednji del (osrednja beta plošča s stranskimi heliksi) deluje kot platforma za ssDNA in koordinira kovinski ion (triada His ostankov). Na vrhu proteina sta kazalec in sredinec (krajši elementi: heliks, beta plošča in zanka), ki primeta lasnično zanko na DNA, nižje je palec (daljši zavoj in krajši heliks na C-koncu) ovije ssDNA in jo usmeri proti aktivnem mestu. Prstanec, mezinec in spodnji del dlani (heliks in dva zavoja) držita DNA v aktivnem mestu.

REPRESORJI

V družini RCR plazmidov je replikacija kontrolirana s kombinacijo protismerne RNA in Cop proteinom. Pri določenih plazmidih pri regulaciji sodeluje tudi MobM relaksaza.

Protismerna RNA II

Ta mehanizem regulira sintezo RepB proteina, ki je ključen za replikacijo plazmidov (je iniciator RCR replikacije, veže se na mesto ori in razvije DNA verigi-relaksacija). copG-repB mRNAje pod nadzorom represorja CopG, ki se veže na Pcr promotor (inhibicija transkripcije). Poleg tega je sinteza RepB kontrolirana na nivoju translacije z vezavo protismerne RNA II in blokado ribosomskega vezavnega mesta. RNA II tvori strukturo iz lasnične zanke z repom (8-bp dolgo steblo z 1-nt veliko izboklino in 6-nt dolgo zanko, ki ji sledi 5' končni enoverižni rep). Terminacijsko zaporedje vsebuje odsek U ostankov značilnih za prokariontske terminatorje neodvisne od Rho.¬ copG-repB mRNA ima kompleksnejšo strukturo od RNA II. Proti 5' koncu zapisa za repB se nahajajo vsaj tri lasnične zanke, ki predstavljajo vezavno mesto za RNA II.

Transkripcijski represorski protein CopG

Cop represorji so majhni sferični dimerni DNA vezavni proteini z RHH motivom (Arg, His, His). Zvijanje in dimerizacija potekata sočasno. Vežejo se na specifično regijo, ki vsebuje cop-rep promotor. Regija je približno 48 nt dolga. Nanjo se vežejo štirje dimeri CopG, ki verigo zvijejo pod kotom 120°. CopG interagira z velikim žlebom DNA z N-koncem beta traku in osrednjimi fosfatnimi skupinami. To povzroči kompresijo velikega in majhnega žleba (spremebe v deoksiriboznih obročih baz) ter posledično 60-stopinjski upogib DNA verige. Kooperativna vezava CopG onemogoči vezavo RNA polimeraze (RNAP), v primeru, da je ta že vezana na promotor, jo lahko izpodrine. Da to doseže se veže na nasprotni heliks in z zvitjem verige izpodrine RNAP.

GOSTITELJEVE FUNKCIJE

PcrA helikaza

Replisom RCR plazmidov potrebuje helikazo, da odvije dsDNA pred replikacijo. Helikaza, ki jo uporabijo G+ bakterije je navadno PcrA, G- bakterije pa navadno uporabijo UvrD. Proteina si delita približno 40% DNA zaporedja. Ključen korak RCR iniciacije je zareza v DNA, ki jo naredi RepC iniciator (kodiran na plazmidu) in vezava helikaza, ki začne odvijati DNA. Ta se veže pred RepC in skupaj z njim oblikuje krožen kompleks, ki povzroči formacijo lasnične zanke na dso (= ori). Helikaza in RepC interagirata že pred rezanjem DNA, kar vodi do strukturnih sprememb na DNA, ki omogočijo začetek replikacije. Brez te vezave ne pride do pravilne usmeritve lasnične zanke na dso (DNA se zasuka samo za 1,5 obrata). Delovanje proteinov je hkratno (cepitev RepC in odvijanje DNA s PcrA). Vezava SSB pospeši hitrost odvijanja, saj inhibira ssDNA rehibridizacijo.

DNA giraza

Sproščeni plazmidi morajo preiti v dodatno zvito obliko preden se lahko replicirajo ali prenašajo med celicami. Njihovo zvitje je pomembno tudi za RepB in MobM proteina, saj sta ju na podlagi tega sposobna prepoznati. Prepoznata samo dodatno zvito DNA. Dodatno zvitje v celicah nadzira DNA giraza. Kot posledica njenega delovanja se sposobnost replikacije plazmida v določenem gostitelju razlikuje. Giraza torej vpliva na ravnovesje med sproščeno in dodatno zvito obliko plazmidne DNA. Če so molekule plazmida preveč sproščene (zaradi aktivnosti MobM), se morda ne bodo učinkovito replicirale, kar bi lahko zmanjšalo število molekul plazmidov, ki so na voljo za replikacijo. Nasprotno, če so molekule plazmida preveč dodatno zvite (DNA giraza), se morda ne bodo učinkovito prenašale med celicami.

ZAKLJUČEK

RCR plazmidi se zaradi svoje majhne velikosti in majhne genetske obremenitve z lahkoto širijo med bakterijami. Ob enem pa predstaljajo nudijo bakterijam ključne gene odgovorne za njihovo preživetje. Razumevanje njihovega delovanja je ključnega pomena za preprečitev širjenja odpornosti na različne antibiotike.