Silinker

Silinker - povezovalni protein za modifikacijo na površini mezoporoznih silikatnih nanodelcev

Skupina BNU China je v letu 2023 sodelovala na iGEM tekmovanju, na katerem je prejela zlato medaljo.

Več o njihovem projektu najdemo na naslednji povezavi: https://2023.igem.wiki/bnu-china/index.html

Avtorica povzetka: Nuša Brdnik

Uvod

Mezoporozni silikatni nanodelci (MSN) imajo velik potencial za uporabo v biomedicinske namene. Ti nanodelci imajo namreč številne prednosti, saj so biokompatibilni, imajo visoko kapaciteto vezave zdravil. Poleg tega sta velikost in oblika nanodelcev lahko prilagodljivi glede na zahteve. Možnost funkcionalizacije proteinov na površino MSN je ključna za biomedicinsko uporabo, kot so usmerjena dostava zdravil, diagnostika, tkivno inženirstvo in dostava nukleinskih kislin. Trenutno obstaja več načinov modifikacij površine nanodelcev za vezavo proteinov, vendar ima vsak svoje pomanjkljivosti in omejitve. Zato so si v ekipi BNU-China za cilj zadali razviti enostavno ter univerzalno metodo za vezavo proteinov na MSN. Izhajali so iz metode vezave proteinov na MSN, ki temelji na fuzijskem proteinu LPG, ki sestoji iz silikagel vezavnega peptida (SBP) in proteina G, ki veže protitelesa. Cilj tega projekta je bil razviti povezovalec na osnovi fuzijskega proteina LPG z visoko afiniteto vezave in z možnostjo vezave različnih proteinov.

Zasnova osnovnega silinkerja Basic silinker (BS)

Oblikovali so povezovalni protein, ki na C-koncu preko SBP učinkovito veže silikagel. Za vezavo proteinov so na N-konec vezali monomer streptavidina (mSA), ki je zmožen vezave biotiniliranih proteinov. Oba konca povezuje rigidni linker. Konstrukt so pripravili v vektorju pETDuet-1 s katerim so transformirali bakterijske celice E. coli BL21 (DE3). V konstrukt so vključili trxA oznako za izboljšanje topnosti proteina, His oznako za izolacijo proteina z afinitetno kromatografijo in cepitveno mesto za trombin za odstranitev omenjenih oznak. Konstrukt so izražali v ekspresijskem sistemu T7 z dodatkom IPTG. Končni konstrukt BS lahko najdemo pod kodo BBa_K4623009.

Zasnova ostalih povezovalnih proteinov

Poleg osnovnega silinkerja so si zamislili različne dizajne silinkerjev, vsakega za specifično biološko aplikacijo. Zasnovali so Cut silinker (CS), s katerim so vnesli specifična cepitvena mesta, ki omogočajo encimsko sproščanje vezanega proteina. Dizajnirali so silinker s cepitvenim mestom za MMP2 kot način specifične dostave do tumorskih celic, kjer je pogosto prisotno povečano izražanje matričnih metaloproteaz. Nato so želeli dizajnirati silinker, ki bi v odziv na stimulus iz okolice spremenil konformacijo in sprožil sproščanje tovora nanodelcev. Slednjega so poimenovali Twisted silinker (TS). V strukturo so vključili kalmodulin, ki po vezavi kalcijevih ionov spremeni strukturo v zvito konformacijo in približa tarčni protein silicijevim nanodelcem. Nato so oblikovali Pairing silinker, ki dimerizira v prisotnosti kalcijevih ionov. Uporabili bi ga lahko npr. za aktivacijo specifičnih encimov ali aktivacijo fluorescence. Dizajnirali so tudi Nucleotide silinker, povezovalni protein z nukleinsko kislino, ki deluje kot na signal odzivni adapter. Osnovni Silinker BS so modificirali tako, da so na mSA pripeli relaksazo Trwc, bakterijski encim, ki se na N-koncu kovalentno poveže na 5- konec specifičnih DNA zaporedij.

Rezultati

Optimizacija konstrukta, izražanja in izolacije rekombinantnih proteinov

Sprva so oblikovali protein s fleksibilnim povezovalcem, vendar ko so v Alpha Fold 2 napovedali strukturo, so opazili prekrivanje SBP in streptavidina, kar bi lahko onemogočilo vezavo na tarčni protein. Fleksibilni povezovalec so nadomestili z rigidnim, ki ima zaporedje EAAAK, s čimer so ločili SBP in streptavidin. Zaradi težav z izražanjem topnega proteina, so dodali oznako trxA za povečanje topnosti. Da bi tem bolj zmanjšali nastajanje inkluzijskih telesc, so izvedli indukcijo z IPTG pri različnih temperaturah in koncentracijah IPTG-ja. Optimalno izražanje proteina so dosegli z 1 mM koncentracijo IPTG-ja. Indukcijo so izvajali 16 ur pri 16 ⁰ C. Protein so izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo in ga eluirali z dodatkom 500 mM imidazola. V izolacijski pufer so dodali biotin, saj se je izkazalo, da pripomore k pravilnemu zvitju proteina. Da bi izolirali Silinker s prostimi vezavnimi mesti za biotin, so morali razviti postopek za odstranitev morebiti vezanega biotina. Najprej so s trombinom cepili oznako trxA, s čimer se izpostavi mSA vezavno mesto za biotin. Nato so proteinsko mešanico nanesli na kolono s silikagelom. Za spiranje biotina so uporabili 100 mM Tris-HCl pufer pri 75 ⁰ C, nato so silinker eluirali z elucijskim pufrom, s čimer so uspešno izolirali silinker z nezasedenimi vezavnimi mesti za biotin. Sestavo elucijskega pufra so optimizirali, s čimer so hkrati razvili metodo za regeneracijo BS po vezavi na silikagel. Pri izolaciji ostalih rekombinantnih proteinov so naleteli na kar nekaj težav. Po več poskusih so izvedli uspešno izolacijo in nadaljnje teste biološke aktivnosti le za Twisted silinker in Paired silinker.

Testi funkcionalnosti osnovnega silinkerja (BS)

Analizirali so sposobnost vezave silinkerja na silikagel. BS in silikagel so inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi, centrifugirali, spirali nevezane proteine ter nato eluirali vezano frakcijo za analizo s SDS PAGE. Na gelu so zaznali liso, velikosti 33 kDa, kar ustreza BS, s čimer so potrdili uspešno vezavo na silikagel. Nato so analizirali sposobnost vezave biotiniliranih tarčnih proteinov na mSA. Za testno vezavo so izbrali biotiniliran goveji serumski albumin (BSA). Pri tem so izvedli kontrolo, kjer so vezali BSA samo na silikagel, da bi določili, ali se protein adsorbira na površino. BSA so vezali na silinker, vezan na silikagel, nato so sistem denaturirali in analizirali rezultate s SDS PAGE. Pokazali so, da se BSA uspešno veže na silinker. Manjšo količino proteina so sicer zaznali tudi v frakciji spiranja. Pri vezavi BSA na silikagel, niso zaznali lise, ki bi ustrezala proteinu po dodatku denaturanta, medtem ko so ga zaznali v frakcijah spiranja, kar potrjuje, da se BSA ne adsorbira na površino. Da bi vizualizirali modifikacijo proteina na površini silikagela, so na silinker vezali biotinilirani zeleni fluorescenčni protein e-GFP. Na mikroskopski preparat so nanesli BS-eGFP in samo e-GFP za primerjavo. Pokazali so, da eGFP uspešno ohrani svojo funkcijo tudi po vezavi na silinker BS. Izvedli so tudi strukturne analize z UV spektroskopijo in cirkularnim dihroizmom, s katerimi so potrdili, da se rekombinantni protein pravilno zvije ter da povezovalni del silinkerja ne vpliva signifikantno na strukturno stabilnost mSA.

Twisted silinker (TS)

Da bi vizualizirali konformacijske spremembe proteina oz. potrdili pravilno zvitje proteina, so poleg osnovnega konstrukta dizajnirali konstrukt s cpGFP (TS-GFP). Po vezavi kalcijevih ionov, se kalmodulin aktivira. V aktiviranem stanju lahko veže kalmodulin vezavni peptid (CBP), kar povzroči spremembo konformacije cpGFP in sevanje svetlobe valovne dolžine 510 nm. Da bi potrdili, da izoliran protein predstavlja TS, so izvedli prenos western preko detekcije histidinske oznake, vendar neuspešno. Da bi potrdili konformacijske spremembe TS v prisotnosti kalcijevih ionov, so izvedli nativni PAGE s koncentracijskim gradientom kalcijevih ionov, vendar na gelu niso zaznali nobenih vidnih lis. Da bi potrdili pravilno zvitje in funkcijo TS-GFP, so merili fluorescenco proteina v odvisnosti od koncentracije kalcijevih ionov, vendar kljub upoštevanju številnih spremenljivk eksperimenta in številnim poskusom, niso mogli zaključiti, da se protein pravilno zvije. Potrdili so le, da se je TS sposoben vezati na silikagel.

Paired silinker (PS)

Po več poskusih in optimizaciji izolacije so uspešno izolirali Paired silinker za nadaljnje analize. PS so vezali na silikagel in analizirali rezultate s SDS PAGE. Potrdili so sposobnost vezave proteina. Na gelu so zaznali signifikantno liso velikosti 90 kDa, kar ustreza velikosti dimeriziranega PS. Želeli so dodatno potrditi dimerizacijo proteina v prisotnosti kalcijevih ionov, vendar so bili poskusi ločevanja dimera z velikostno izključitveno kromatografijo in z nativnim PAGE neuspešni. Na kromatogramu niso zaznali nobenih absorpcijskih vrhov in na gelu niso opazili nobenih lis. Predvidevajo, da naj bi bila težava v prisotnosti silikagela v instrumentih, uporabljenih za velikostno izključitveno kromatografijo in nativni PAGE. Zaradi omejenega časa nadaljnjih analiz niso uspeli izvesti.

Cilji za prihodnost

Zaradi omejenega časa niso uspeli uspešno izolirati in potrditi funkcionalnost vseh proteinov. Silinker so izrazili le v prokariontskem sistemu, kar je predstavljalo težave z izolacijo topnih proteinov. V prihodnosti želijo rekombinantne proteine pripraviti v evkariontskih ekspresijskih sistemih. V prihodnosti tudi želijo optimizirati konstrukte silinkerjev in izvesti analize na mezoporoznih silikatnih nanodelcih.