OTTER

OTTER (angl. Optimized Technique for swiTch Engineering and Ranking) je projekt ekipe iz Singapurja, s katerim se je udeležila tekmovanja iGEM leta 2023.

Cilj projekta je bil priprava orodja OTTER in visokozmogljive metode za karakterizacijo RNA-stikal SIGNAL (angl. Scalable Information Generation for Nucleic Acid Lineage Assessment Workflow). Orodje OTTER ustvari zaporedje RNA-stikala in predvidi učinkovitost delovanja. S SIGNAL se eksperimentalno ovrednoti delovanje RNA-stikal. Namen je bil, da s SIGNAL pripravijo veliko število podatkov o delovanju parov tarčno zaporedje in RNA-stikalo in s pridobljenimi podatki pripravijo računalniški model za OTTER.

Za ta projekt so se odločili zaradi pomanjkanja orodij za napovedovanje interakcij RNA-RNA, ustvarjanja RNA-stikal in pomanjkanja zbirk podatkov o RNA-RNA interakcijah s katerimi bi lahko pripravili modele za napovedovanje interakcij RNA-RNA. V projektu so se osredotočili na RNA-stikala, ki so občutljiva na prisotnost specifičnih RNA [1].

RNA-stikalo je del mRNA, ki glede na prisotnost liganda uravnava izražanje gena. RNA-stikala tvorijo posebno sekundarno strukturo, ki je občutljiva na prisotnost liganda. Ob prisotnosti tega, se spremeni sekundarna struktura, kar spremeni izražanje. RNA-stikala lahko uravnavajo iniciacijo, terminacijo ali razpolovni čas transkripta [2].

SIGNAL

Visokozmogljiva metoda za ovrednotenje RNA-stikal temelji na eno-plazmidnem sistemu, ki omogoča pozitivno in negativno selekcijo parov RNA-stikalo in tarčno zaporedje. S tem zmanjšamo število transformacij, ki so potrebne za ovrednotenje delovanja RNA-stikala. V plazmidu sta tarčno zaporedje in RNA-stikalo z reporterjem pod ločenimi inducibilnimi promotorji. Skupaj z reporterjem se izrazita tudi selekcijska markerja, ki omogočata pozitivno in negativno selekcijo. To sta protein, ki omogoča rezistenco proti antibiotiku in sacB. SacB je levansaharaza. Pretvarja sahafozo (disaharid iz glukoze in fruktoze) v levan. Levan je polisaharid, sestavljen iz fruktoze, povezane z 2,6-β glikozidnimi vezmi. Levan je znotraj Escherichia coli strupen. Natančen mehanizem delovanja levana na E. coli še ni znan [1,3].

Z rezistenčnim markerjem se omogoča rast celicam v katerih se tarčno zaporedje veže na RNA-stikalo in tako omogoča izražanje proteina, ki omogoča rezistenco. Z dodatkom saharoze k celicam, ki nimajo induciranega izražanja tarčne RNA ubijemo celice v katerih RNA-stikalo ne zavira izražanja. S tem lahko izločimo RNA-stikala, ki so tekom mutageneze izgubila funkcijo [1].

Priprava eno-plazmidnega sistema

Sprva so pripravili eno-plazmidni sistem z RNA-stikali toehold. Ti tvorijo lasnično zanko z vezavnim mestom za ribosom (RBS) in začetnim kodonom. Z vezavo tarčne RNA se lasnična zanka razvije in je ribosomu omogočena vezava. Izražanje tarčne RNA je pod kontrolo promotorja pLac. Tega se v laboratoriju inducira z dodatkom izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG). Pod kontrolo promotorja pTet, ki se ga inducira ob dodatku anhidrotetraciklina (ATC) je bil transkript, ki je vseboval RNA-stikalo, ki je nadzorovalo izražanje zapisa za zeleni fluorescenčnim protein (sfGFP) povezan s sacB [1].

Pripravljen plazmid ni deloval kot pričakovano. Ravni izražanja sfGFP so bile enake pod vsemi kombinacijami induktorjev. Za kontrolo so pripravili plazmid, kjer je bilo izražanje sfGFP le pod kontrolo pTet. Pri tem plazmidu je bilo izražanje sfGFP očitno. Neuspešnost so pripisali temu, da so originalne konstituitivne promotorje zamenjali za inducibilne. To naj bi motilo interakcijo med tarčno RNA in RNA-stikalom. Odločili so se uporabiti drugačno vrsto RNA-stikal, ki se imenujejo angl. small transcription activating RNAs (STAR) [1].

Literatura

[1] OTTER | NUS-Singapore. https://2023.igem.wiki/nus-singapore/

[2] C. M. Schmidt in C. D. Smolke: RNA Switches for Synthetic Biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2019, 11:a032532.

[3] Levan polysaccharide. Wikipedia, 2024.