CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.

UVOD

Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

Izvedba projekta

Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

Delecija PHB

PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.

Regulacija in sinteza modula

Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja glnK in nifH, ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.

Samomorilski mehanizem razlaga

Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

Transport DHA in EPA v sojo

Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.

Viri in literatura

[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)