Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

Izhodiščni članek: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths

Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:

• E. coli: medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
• B. subtilis: 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
• C. glutamicum: približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
• P. pastoris: aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti,
• S. cerevisiae: medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1.

Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

Zaključek

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

Literatura

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. 2021, 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth Syst Biotechnol 2025, 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. 2017.