Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

Izhodiščni članek: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths

Uvod

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (angl. broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (E. coli JM109, B. subtilis 168, C. glutamicum ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (S. cerevisiae CEN.PK2-1C, P. pastoris GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za E. coli in B. subtilis, BHI za C. glutamicum ter YPD za S. cerevisiae in P. pastoris [2].

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja P_bs v E. coli

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz E. coli, in sicer genov rrnD, rybB in rpoE, UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz E. coli, ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz B. subtilis, ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ⁵⁴, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v B. subtilis, in sicer 300 %. Pri C. glutamicum je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2]. Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz P. pastoris ter promotor TDH3, ki izvira iz S. cerevisiae. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v S. cerevisiae dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v P. pastoris, hkrati pa je GAP, endogeni promotor P. pastoris, v S. cerevisiae izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V P. pastoris so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v S. cerevisiae pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:

• E. coli: medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
• B. subtilis: 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
• C. glutamicum: približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
• S. cerevisiae: medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
• P. pastoris: aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.

Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

Zaključek

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

Literatura

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. 2021, 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. 2025, 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. 2017.