Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije

Izhodiščni članek: Controlling the expression of heterologous genes in Bdellovibrio bacteriovorus using synthetic biology strategies

UVOD

Bdellovibrio bacteriovorus je obligativna aerobna gramnegativna bakterija, ki ima zaradi svojega posebnega življenjskega cikla in številnih hidrolitičnih encimov, kot že sam vrstni pridevek bacteriovorus pove, zmožnost prehranjevanja z drugimi gramnegativnimi bakterijami. Ideja o uporabi B. bacteriovorus kot živega antibiotika sega že več kot desetletje nazaj in predstavlja eno izmed možnih rešitev za vse večji globalni problem odpornosti bakterij na antibiotike. Življenjski cikel te majhne plenilske bakterije je razdeljen v dve funkcionalno ločeni fazi: faza napada (ang. attack phase), v kateri bakterija kot prosto gibajoča se celica išče plen in faza rasti (ang. growth phase), v kateri se nahaja znotraj periplazme plena, kjer oblikuje bdeloplast. Pri tvorbi bdeloplasta spremeni celično steno plena v okroglo obliko. Med rastjo (oz. elongacijo) in delitvijo (oz. septacijo) na 4 do 6 hčerinskih celic si zagotavlja hranila iz gostiteljske celice. Nove bakterije povzročijo lizo celične stene. B. bacteriovorus pa ponovno preide v fazo napada, kjer se lahko prosto premika in je neodvisna od gostitelja. Zlasti omejena razpoložljivost genetskih orodij za regulacijo izražanja genov, saj ne gre za klasično modelno bakterijo, kot je npr. E. coli, je doslej predstavljala veliko oviro pri njeni biotehnološki uporabi. Zato se je Salgado s sodelavci odločil razviti in prilagoditi orodja sintezne biologije za široko uporabnost te bakterije. Cilj te študije je vzpostaviti robusten sistem za kontrolirano izražanje heterolognih genov v B. bacteriovorus HD100.

UPORABA KLONIRNE TEHNIKE GOLDEN STANDARD (GS) IN KROMOSOMSKE INSERCIJE Z UPORABO TRANSPOZONSKEGA SISTEMA Tn7 NA BAKTERIJAH B. BACTERIOVORUS

Najprej je bila razvita Golden standard (GS) tehnika, ki temelji na hierarhičnem kloniranju po principu Golden Gate, tako da omogoča izražanje heterolognih genov z uporabo replikativnih plazmidov. Tipično se pri GS uporabi plazmide SEVA. Za ogrodje sta bila izbrana dva plazmida SEVA s širokospektralnim ori RSF1010 (pSEVAX5X), in sicer pSEVA251 in pSEVA651, ki posamično vsebujeta gena za odpornost proti kanamicinu (Km) oziroma gentamicinu (Gm). Omenjena plazmida so najprej »domesticirali« z odstranitvijo dveh restrikcijskih mest za BpiI, tako da so nastali plazmidi pSEVAX51-dom. Nato so konstruktom na nivoju 1 dodali še proteinski tovor lacZα ter dobili končna prilagojena plazmida pSEVA2519[g2] in pSEVA6519[g2], katerim je bilo možno z modularnostjo zamenjati posamezne osnovne dele - za namene karakterizacije promotorjev so zamenjali različne promotorje. Dobljeni replikativni plazmidi pa so brez selekcijskega pritiska nestabilni (tj. v tem primeru brez prisotnosti antibiotika), zato so uvedli še dodaten pristop. Z uporabo transpozonskega sistema Tn7, ki omogoča integracijo ene same kopije v specifično, nekodirajoče zaporedje (ang. attTn7 site), ki se nahaja za genom glmS, so dosegli stabilno izražanje. Za to so kot osnovno ogrodje uporabili drug plazmid pTn7-M. Izvedli so še restrikcijo s PacI in SpeI ter ligacijo in s tem ustvarili končne plazmide pTn7-19[g2] in pTn7-19[gE] na nivoju 1 oziroma 2. Uporabljeni so bili različni selekcijski markerji: streptomicin (Sp) za nivo 0, kanamicin (Km) za nivo 1 in gentamicin (Gm) za nivo 2, Km in Gr sta bila uporabljena tudi za Tn7 konstrukte. Pristop je omogočil natančno kontrolo nad mestom in številom integracijskih dogodkov, kar je ključnega pomena pri nemodelnih organizmih z nepredvidljivim odzivom na selekcijo. V prekonočni kulturi so s modro-belim testom izbrali bele kolonije za čiščenje plazmidov. Za kontrolo so izvedli še sekvenciranje.

KONSTRUKCIJA SEVOV Z IZRAŽENIM mRFP1

Predhodno so bili izvedeni eksperimenti, pri katerih so pod vplivom nativnih promotorjev izražali heterologne proteine, med drugim tudi monomerni rdeči fluorescenčni protein mRFP1. Uporaba heterolognih promotorjev pa zahteva večjo pozornost, saj je močno odvisna od združljivosti transkripcijskega mehanizma, pri čemer so eni izmed pomembnejših faktorjev faktorji σ. In silico analize so pokazale, da sta poddomeni 2.4 in 4.2 faktorja RpoD, ki sta odgovorni za vezavo na DNA tako pri B. bacteriovorus HD100 in E. coli K-12 visoko homologni (100 % in 96,6 % identičnosti). Postavljena je bila hipoteza, da so promotorji, odvisni od σ⁷⁰ za E. coli prepoznavni tudi za RpoD pri B. bacteriovorus.

KARAKTERIZACIJA KONSTITUTIVNIH IN INDUCIBILNIH PROMOTORJEV

Salgado in sodelavci so se odločili za karakterizacijo šestih sintetičnih konstitutivnih promotorjev (P_J102, P_J106,P_J116, P_BG25, P_BG37, P_BG42) različnih moči (trije so bili iz Andersonove zbirke, preostali trije pa iz Zobelove zbirke) na podlagi izražanja monomernega rdečega fluorescenčnega proteina mRFP1. Vsi ti promotorji so bili znani kot konstitutivni promotorji pri pogostih bakterijskih modelih, kot sta E. coli in/ali P. putida. Prav tako so želeli karakterizirati pet inducibilnih promotorjev na podlagi izražanja msfGFP – monomernega zelenega fluorescenčnega proteina z izboljšanim zlaganjem. Uporabljeni so bili sledeči inducibilni promotorski sistemi: P_JExD/EliR, P_b/ChnR, P_BAD/AraC, P_rhaBAD/RhaSR in P_m/XylS. V vseh primerih se RBS (uporabljen BCD2) in terminatorja (uporabljen rnpB_T1) ni spreminjalo. Kot negativni kontroli so dizajnirali nefunkcionalno promotorsko zaporedje (pL0-P₀-AB), ki je nadomestilo promotor ter še ‘prazen vektor’, ki ni imel kodirajočega zaporedja (pL0-ncTU-AI). Pri transfekciji so uporabili triparentalno razmnoževanje za replikativne plazmide in štiriparentalno razmnoževanje za integrativne plazmide. Ker še nikoli doslej ni bila izvedena konjugacija na tak način pri tej bakterijski vrsti, so pregledali učinkovitost transfekcije za vsak konstrukt posebej.

REZULTATI

Uspešnost transfekcije je bila izmerjena v plakotvorni enoti (ang. plaque-forming unit, PFU). Pri transfekciji replikativnih plazmidov so ugotovili, da se uspešnost giblje med 10⁻⁷ in 10⁻³, medtem ko je bila frekvenca pri kromosomski inserciji s Tn7 dosledno uspešna z učinkovitostjo 10⁻⁶ za vsak konstrukt. Enako je bilo opaženo tudi vizualno, z oceno fenotipa pod mikroskopom. Za potrditev stabilnosti so izvedli še dve serijski kokulturi brez selekcijskega pritiska, ki sta pokazali, da je po devetih generacijah prišlo do signifikantno znižane vrednosti Gm^R celic pri sevu HD100 [pSEVA6519[g2]-ncTU, medtem ko ni prišlo do razlik pri sevih z integriranimi konstrukti. Dodatno so stabilnost preverili še s pretočno citometrijo, kjer so opazili dva ločena vrhova, ki se nanašata na dve populaciji z različno izraženim mRFP1. Pri celicah z integriranim konstruktom je bil opažen en sam vrh (homogena populacija). Ker je bilo potrebno uporabiti kokulturo večih različnih bakterij (plena in plenilca) se na podatke OD₆₀₀ niso mogli zanašati. OD₆₀₀ je v tem primeru padal, zaradi vedno manjše količina plena. Za interpretacijo so zato vzeli le absolutno vrednost fluorescenčnega signala, ki je koreliral s rastjo in delitvijo B. bacteriovorus. Za karakterizacijo promotorjev so vzeli absolutno metodo merjenja fluorescence zgolj v sevih z integriranim konstruktom, saj so želeli delati z homogeno populacijo. Rezultati so pokazali, da je moč konstitutivnih promotorjev pri treh primerljiva z referenčnimi organizmi, pri ostali polovici pa je bila moč različna - P_BG37, ki sicer velja za srednje močen promotor, je pri B. bacteriovorus močen promotor, ravno obratno pa je P_J106 deloval kot šibek promotor. P_J116, ki je v E. coli šibek promotor, je tukaj bil srednje močen. Pri sevih z vgrajenimi inducibilnimi promotorji je bil fluorescenčni signal opažen le pri P_JExD in P_b. Oba sta odvisna od koncentracije dodanega induktorja, kar je bilo potrjeno tudi s pretočno citometrijo. Analiza Hillove krivulje je pokazala, da je močnejši promotor P_JExD, s višjo inducibilnostjo in nižjo bazalno aktivnostjo. Dodatne analize so potrdile, da je ta promotor primeren za nadaljnje aplikacije v B. bacteriovorus. Glede na to, da konstrukti z ostalimi testiranimi inducibilnimi sistemi niso izrazili msfGFP, to potrjuje le na pomen testiranja združljivosti v vsakem posameznem gostitelju zaradi specifičnih mehanizmov znotraj posamezne vrste. Možni vzroki za konkretne promotorje so različni.

ZAKLJUČEK

Študija je uspešno razširila in validirala repertoar genetskih orodij za spreminjanje genoma B. bacteriovorus in dokazala, da so promotorji odvisni tudi od faze, v kateri se bakterija nahaja. Nov sistem nudi možnosti uporabe v številne različne namene, vse od medicine pa do akvarike.