Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR:

miRADAR je projekt ekipe WageningenUR iz Nizozemske, ki je na tekmovanju iGEM 2024 prejel nagrado za najboljši diagnostični projekt in bil uvrščen med najboljših 10 projektov.

Uvod

Multipla skleroza (MS) je avtoimuna bolezen, ki prizadene centralni živčni sistem. Zdravi živci so obdani z mielinskimi ovojnicami, ki delujejo kot zaščitna pregrada, poleg tega pa tudi pospešujejo prenos signala po živcih. Pri MS imunski sistem napade in poškoduje mielinske ovojnice. Na teh območjih se tvori brazgotinsko tkivo, ki povzroča težave pri prenosu signala. Ker pride do poškodbe v centralnem živčnem sistemu, so prizadeti različni deli telesa.

MS je zaenkrat še neozdravljiva bolezen, lahko pa napredovanje bolezni upočasnimo. Zato je ključna zgodnja diagnoza, saj lahko bolezen, med čakanjem na diagnozo, povzroči trajno škodo. Trenutne diagnostične metode (MRI in lumbalna punkcija) so dolgotrajne in invazivne, zato je ekipa WageningenUR iz Nizozemske razvila novo diagnostično metodo, ki temelji na detekciji miRNA.

Cilj

miRADAR je preprost papirnati brezceličen test, narejen za lažje diagnosticiranje MS. Ta test temelji na detekciji specifične kombinacije mikro-RNA (miRNA) v krvi. miRNA so majhne molekule RNA (19-25 nukleotidov), ki lahko uravnavajo izražanje različnih genov in imajo tako ključno vlogo pri različnih celičnih procesih.

miRNA so prisotne v krvi v določenih koncentracijah, pri nastanku bolezni pa pride do spremenjenega izražanja, kar se kaže v povišanih ali znižanih koncentracijah miRNA v krvi. Če poznamo točno kombinacijo miRNA, ki se spremenjeno izražajo pri določeni bolezni, lahko na ta način uspemo diagnosticirati bolezen.

Potek projekta

Projekt so začeli z raziskovanjem literature in računalniškim delom. Najprej so morali identificirati specifično kombinacijo miRNA, ki je značilna za MS, nato so morali ustvariti sistem za določanje praga miRNA, na koncu pa še oblikovati t.i. »toehold« stikala za detekcijo miRNA.

Za identifikacijo specifične kombinacije miRNA so uporabili algoritem strojnega učenja, ki temelji na podatkih o izražanju miRNA pri bolnikih z MS in pri zdravih ljudeh, ter tako našli sedem miRNA, ki so pri MS drugače izražene. Pregledali so še podatke o izražanju miRNA pri t.i. mimičnih boleznih. Te bolezni otežujejo diagnosticiranje MS, saj imajo podobne simptome. Pet izmed sedmih, za MS specifičnih, miRNA so zaznali pri različnih mimičnih boleznih. Zato so spet uporabili algoritem strojnega učenja in poiskali miRNA, ki se pojavljajo samo pri mimičnih boleznih, ne pa pri MS – identificirali so eno tako miRNA. S temi osmimi miRNA lahko naredimo logično vezje, s katerim lahko razločimo ali gre za MS, mimično bolezen ali zdrave ljudi.

Nato so morali narediti sistem, s katerim bi določili, katera koncentracija specifičnih miRNA razlikuje med zdravimi ljudmi in bolniki z MS – sistem za določanje praga miRNA. Uporabili so sistem TMSD (angl. toehold mediated strand displacement), ki temelji na kombinaciji štirih RNA verig – verige A (miRNA iz krvi), verige B (inhibitorna RNA), verige C (sprožilna RNA) in verige D (izhodni signal). Prag je določen s koncentracijo proste verige B in vezane verige B v dupleksu BC. Veriga A ima večjo afiniteto do verige B kot veriga C, zato lahko veriga A izpodrine verigo C iz dupleksa BC. Veriga C pa se nato veže na verigo D, pri tem pa dobimo izhodni signal. Če je verige A več kot verige B, bo začela izpodrivati verigo C iz dupleksa BC in bomo dobili izhodni signal, v nasprotnem primeru pa ne. Za testiranje sistema so kot verigo D uporabili t.i. špinačni aptamer (RNA oligomer, ki lahko veže fluoroforno molekulo DFHBI) – ko se veriga C veže na špinačni aptamer pride do spremembe konformacije, ki zdaj omogoča vezavo fluorofora (molekule DFHBI), kar lahko zaznamo z merjenjem fluorescence. V končnem testu so kot izhodni signal namesto špinačnega aptamera uporabili encimsko reakcijo pretvorbe CPRG (klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid) v CPR (klorofenol rdeče), kjer je vidna barvna sprememba.

Na koncu pa so morali narediti še »toehold« stikalo. To je RNA stikalo, ki ima v zanki skrito vezavno mesto za ribosom (RBS) in start kodon, na začetku zaporedje »toehold«, na koncu pa gen, ki se ne more prevajati. Na taka »toehold« stikala se mora vezati sprožilna RNA (na »toehold« zaporedje), ki linearizira stikalo, pri čemer postane RBS dostopen za vezavo ribosoma in lahko začne prevajati zapisan gen. WageningenUR ekipa je s programskim orodjem SwitchMi Designer oblikovala »toehold« stikala, ki vsebujejo zapis za β-galaktozidazo, ki lahko pretvarja rumen CPRG v vijoličen CPR – na ta način za diagnozo ne potrebujemo nobenih dodatnih aparatur, ampak vidimo spremembo barve s prostim očesom.

Eksperimentalno delo

Delovanje sistema za določanje praga so preverili z merjenjem fluorescence. Ugotovili so, da mora biti razmerje verig C in D 1:1. Če bi bilo verige D preveč, se lahko na odvečne verige poleg verige C veže tudi veriga A, kar lahko da lažno pozitivne rezultate. To so preverili z uporabo programskega orodja NUPACK. Poleg tega so ugotovili tudi to, da mora biti razmerje verige B proti verigam C ali D 3:1, saj so le na ta način dobili ustrezen prag. Previsoke koncentracije verige B namreč delujejo inhibitorno – zaznali so zmanjšanje fluorescence.

Delovanje »toehold« stikala so preverili z merjenjem absorbance produkta CPR. Z njihovim programskih orodjem (izboljšana različica SwitchMi Designer ekipe iGEM UParis BME 2021) so oblikovali dve stikali (A in B), izmed katerih se je B izkazal kot najboljši. To so preverili z merjenjem absorbance in z izvedbo reakcije v mikrocentrifugirki, kjer so samo pri stikalu B opazili ustrezno vijolično barvo. S preprostejšim pristopom (uporaba programskega orodja NUPACK) pa so načrtali še eno »toehold« stikalo, ki pa ni bilo tako uspešno – niso zaznali nobene spremembe v barvi. Iz tega so sklepali, da je uporaba namenskega orodja za oblikovanje »toehold« stikal boljša in je tudi bolj priporočena.

Delovanje testa

Pred uporabo testa je potrebno bolniku odvzeti vzorec krvi, iz katere se nato izolira miRNA (standardne metode v diagnostičnih laboratorijih). Ker so miRNA v krvi prisotne v nizkih koncentracijah, je pred izvedbo testa potreben korak pomnoževanja (ta test potrebuje vsaj nM koncentracije miRNA). Za pomnoževanje se uporabi metodo, ki temelji na zaporedju nukleinskih kislin – NASBA (angl. nucleic-acid sequence-based amplification). Ta metoda omogoča eksponentno pomnoževanje RNA. Pri tej metodi gre za cikel reverzne transkripcije (nastajanja dsDNA matrice) in in vitro transkripcije (pomnoževanje RNA), ki rezultira v visokih koncentracijah miRNA.

Ko imamo ustrezno koncentracijo miRNA se lahko začne s testom. Test je v bistvu papirnat disk, na katerem so posušene in zmrznjene specifične komponente in reagenti. Ko kapnemo pomnoženo miRNA na papirnat disk, gre ta miRNA najprej skozi sistem detekcije praga miRNA, nato pa se specifično kombinacijo miRNA zazna s »toehold« stikali in dobimo izhodni signal.

Ker je za diagnosticiranje MS pomembna specifična kombinacija miRNA, test vsebuje sistem, ki omogoča detekcijo več miRNA hkrati. Test vsebuje logično vezje, ki da izhodni signal le v primeru, ko so prisotne vse potrebne miRNA. Logično vezje je sestavljeno iz vrat IN, ki so nekakšno kompleksno »toehold« stikalo. Taka »toehold« stikala se linearizirajo le takrat, ko se nanje vežejo vse potrebne sprožilne RNA (vezava samo ene sprožilne RNA ne more v celoti linearizirat stikala).

Zaključek

Ekipa WageningenUR je razvila novo diagnostično metodo za enostavnejšo diagnosticiranje zapletenih primerov multiple skleroze. Metoda temelji na detekciji specifične kombinacije miRNA, ki je značilna za multiplo sklerozo. Z laboratorijskimi poskusi so potrdili, da se lahko z njihovimi načrtovanimi »toehold« stikali zaznava specifične kombinacije miRNA in se to uporabi za diagnosticiranje MS. Sicer pa je potrebno narediti še nekaj dodatnih izboljšav, ki bodo naredile test bolj natančen in zanesljiv.