Vloga tsRNA v praživalskih parazitih

Uvod

Molekule tRNA so najbolj znane po svoji vlogi v procesu translacije, nekoliko manj znano pa je, da imajo tudi te RNA molekule številne nekanonične funkcije. Nemodificirane (cele) tRNA molekule med drugim sodelujejo pri destabilizaciji proteinov, sintezi vrste snovi (na primer peptidoglikana in tetrapirolov), regulirajo celični metabolizem in izražanje genov povezanih z aminokislinsko homeostazo ter vplivajo na izrezovanje intronov v primarnem transkriptu mRNA. Pomembne funkcije imajo tudi molekule tsRNA. To so nekodirajoče RNA molekule, ki nastanejo s cepitvijo zrele ali nezrele tRNA. Dolgo so menili, da so tRNA zelo stabilne molekule, zato iz tRNA nastalim malim RNA molekulam (tsRNA) do razvoja naprednejših metod sekvenciranja niso posvečali posebne pozornosti, v zadnjem času pa so odkrili tudi številne mehanizme njihovega nastanka, predvsem v sesalskih in prokariontskih celicah. tsRNA sodelujejo pri regulaciji izražanja genov, sintezi proteinov in prenosu signalov v organizmih vseh treh domen, torej tudi v praživalskih parazitih.

Molekule tsRNA se delijo na tRNA fragmente (tRF) in tRNA polovice, oziroma tiRNA.

Nastanek tRNA polovic

tiRNA nastanejo s cepitvijo zrelih molekul tRNA. Cepijo jih specifične ribonukleaze v antikodonski regiji. Ta proces je bil preučen predvsem v sesalskih celicah, pri katerih so s pomočjo in vitro inkubacije ter in vivo s transfekcijo HeLa celic dokazali, da je ribonukleaza odgovorna za nastanek tiRNA najverjetneje angiogenin. Zanimivo je, da cepitev tRNA molekul ni odvisna od koncentracije angiogenina, ki ostaja v običajnih in stresnih pogojih enaka, temveč je cepitev odvisna od same molekule tRNA, ki se zaradi stresorjev spremeni, ali od proteina RNH1, ki se veže na angiogenin in inhibira njegovo delovanje. Tako pri človeku, kot pri S.cerevisiae, pri kateri tRNA v antikodonski regiji cepi RNaza Rny1, so odkrili tudi od angiogenina neodvisne načine nastanka tRNA polovic, kar je pomembno za preučevanje mehanizmov pri praživalih, ki nimajo angiogenina ali njegovih homologov, a je znano, da pri njih tiRNA še zmeraj nastajajo. Mehanizem nastanka teh struktur in encimi, ki pri tem sodelujejo, so pri praživalih zaenkrat še neznani. Zanimivo je, da je nastanek tRNA polovic evolucijsko tako ohranjen, da ga najdemo v vseh treh domenah, a se zanj odgovorni encimi tako razlikujejo.

Nastanek in vrste tRNA fragmentov

tRNA fragmenti (tRF) nastanejo zaradi cepitve zrelih in nezrelih tRNA molekul zunaj antikodonske regije. Ti fragmenti so dolgi med 13 in 32 nukleotidov in se glede na način nastanka delijo na več različnih tipov. 5' tRF-ji nastanejo iz 5' dela tRNA in so dolgi do 30 nukleotidov. Nastanejo s cepitvijo na D-zanki ali na steblu med D-zanko in antikodonom. 3' tRF-ji so dolgi 18 do 22 nukleotidov, pri njihovem nastanku pa najverjetneje sodeluje encim, ki cepi za A ali U nukleotidi. Obstajajo tudi posebne vrste 3' tRF-jev, ki jih v literaturi imenujejo 3' U tRF ali tRF-1 in nastanejo iz 3' neprevedene regije nezrele tRNA z rezanjem z RNazo Z. RNA fragmenti, ki nastanejo iz osrednjega dela molekule se imenujejo itRNA. Podobno kot pri nastanku tRNA polovic so tudi mehanizmi nastanka fragmentov dokaj neraziskani.

Funkcije tsRNA

Praživalski paraziti se pogosto znajdejo v stresnih situacijah, saj menjavo gostitelja spremljajo spremembe okoljskih pogojev (temperature, pH, vira hranil ...) in v nekaterih primerih diferenciacija iz aktivne v dormantno obliko (tvorba cist). Zaradi tega so paraziti razvili mehanizme hitre prilagoditve na okoljske spremembe. Eden izmed njih vključuje tsRNA, ki igrajo pomembno vlogo pri izražanju genov. Njihove funkcije so v večini parazitov podobne in pogosto ohranjene tudi pri drugih organizmih, ne glede na evolucijsko oddaljenost. Na primer, pri bakterijah cepitev tRNA molekul zavre sintezo proteinov ob okužbi z bakteriofagi in s tem zmanjša tudi sintezo virusnih proteinov. Fragmenti, ki izvirajo iz istega dela tRNA za različne aminokisline, se lahko tudi bistveno razlikujejo v funkciji. Delujejo po dveh mehanizmih: v odvisnosti od Ago proteinov (tRF-5 in tRF-3), s katerimi ciljajo mRNA in zavirajo translacijo, ter neodvisno od njih.

tiRNA/tRNA polovice

Izmed tsRNA je pri praživalskih parazitih najbolj pogosta tvorba tiRNA (s stresom inducirani tRNA fragmenti), ki pa so kljub imenu v celicah prisotne tudi v nestresnih situacijah. tiRNA pod vplivom oksidativnega stresa, toplotnega šoka in pod UV svetlobo zavirajo translacijo, vendar ne po klasičnem mehanizmu, povezanim s fosforilacijo evkariontskega iniciacijskega faktorja eIF2α (najpogostejši način regulacije translacije v evkariontih kot odgovor na stres), temveč po nekem drugem, ki pa zaenkrat še ni pojasnjen. Nekateri izmed parazitov v okolje izločajo vezikle s tRNA polovicami, prek katerih lahko le te vstopajo v okoliške celice in vplivajo na izražanje genov v njih. Poleg tega nekatere tiRNA polovice sodelujejo pri tvorbi stresnih granul neodvisno od eIF2. Pri miših od okoljskih dejavnikov odvisno izražanje tRNA polovic vpliva na epigenetsko dedovanje. Določene 3' tRNA polovice lahko olajšajo vezavo mRNA na ribosom in tako pospešijo translacijo, vendar le, če nimajo CCA repa. Med stradanjem niti fragmenti brez CCA repa tega ne morejo doseči. V obravnavanih parazitih so poleg tRNA polovic opazili tudi druge fragmente tRNA, ki pa jih niso nadaljnje klasificirali, zato se naslednji primeri nanašajo na neparazitske organizme.

3' CCA tRF/tRF-3

Fragment tRF-3006 se veže na vezavno mesto za začetni oligonukleotid (primer) na genomski HIV RNA in s tem služi kot primer za reverzno transkripcijo v njegovem življenjskem ciklu. Fragment tRF-3027 je prisoten v zdravih celicah B. Pri limfomih je odsoten, saj bi drugače zaviral proliferacijo celic in spodbujal celični odziv na poškodbe DNA. Nekateri tRF-3 sodelujejo pri zorenju rRNA.

5' tRF/tRF-5 in itRF/tRF-2

Fragment tRF-5030c interagira z Ago proteini in vpliva na metilacijo histonov. Nekateri izmed tRF-2 delujejo kot tumor supresorji in spodbujajo celični odziv na poškodbe DNA. V rakastih celicah so odsotni.

3' U tRF/tRF-1

Za tRF-1 je značilno, da ne interagirajo z Ago proteini. Eden izmed njih je tRF-1001, ki spodbuja prehod celic iz faze G2 v fazo mitoze in s tem proliferacijo rakastih celic pri raku prostate. tsRNA so v molekularni biologiji še dokaj neraziskano področje, zato mnoge njihove funkcije še niso znane, mehanizmi delovanja pa niso pojasnjeni.

Vloga tsRNA v praživalskih parazitih

tsRNA imajo pomembno vlogo tudi v praživalskih parazitih, ki spadajo v skupino enoceličnih protistov. Njihova tarča so tudi ljudje, povzročajo lahko različne nevarne bolezni.

Eden izmed raziskovanih parazitov je Entamoeba histolytica, ki povzroča amebiazo. V E. histolytici so identificirali različne tsRNA, večinoma tRNA polovice. Večina teh je izvirala iz le štirih različnih tRNA. tRNA polovice se v tem parazitu akumulirajo kot odziv na različne stresne stimulante, kot so oksidativni stres, toplotni šok in serumsko stradanje. Akumulacija tRNA polovic sovpada s spremembami v ravni translacije, in sicer pri oksidativnem stresu se translacija zmanjša, pri toplotnem šoku pa poveča. To potrjuje vlogo tRNA polovic v regulaciji sinteze proteinov v stresnih pogojih. Nekatere izmed identificiranih tsRNA so povezane z Ago proteini, kar kaže na njihovo vlogo pri regulaciji izražanja genov. tRNA polovice so odkrili tudi v ekstracelularnih veziklih, ki so jih izločale amebe, kar kaže na vlogo tsRNA pri medcelični komunikaciji.

Drugi raziskovani parazit je Giardia (Giardia lamblia), ki povzroča giardiazo. V njem so odkrili s stresom inducirane tRNA (si-tRNA), ki nastanejo iz 3’ konca zrele tRNA. Ugotovili so, da se si-tRNA akumulirajo kot odziv na različne stresne pogoje, kot sta temperaturni šok in serumsko stradanje. Poleg tega so odkrili tudi tsRNA, ki naj bi imele ključno vlogo pri procesu diferenciacije v tem organizmu. tsRNA so našli tudi v ekstracelularnih veziklih Giardie. Ti vezikli lahko interagirajo z bakterijskimi membranami, kar poveča njihovo gibljivost in inhibira rast bakterij in nastanek biofilma.

Trypanosoma cruzi povzroča ameriško tripanosomiazo. V tem parazitu so identificirali tsRNA, ki so večinoma nastale iz 5’ polovic zrele tRNA. Izražanje teh tRNA polovic se je povečalo med prehranskim stresom. Zanimivo je, da je več kot 98 % teh fragmentov nastalo iz le treh različnih tRNA. tsRNA so našli tudi v ekstracelularnih veziklih, ki so se izločili v obdobju pomanjkanja hranil, te vezikle pa so lahko sprejele tudi sesalske celice. Vsebina veziklov je vplivala na izražanje genov v teh celicah, predvsem na imunski odziv, citoskelet in zunajcelični matriks.

Trypanosoma brucei je povzročitelj spalne bolezni. V njem so identificirali različne majhne nekodirajoče RNA, med katerimi so bile pogoste tRNA polovice, ki pretežno izvirajo iz 5’ konca tRNA. Izražanje tRNA polovic je bilo močno povečano v stresnih pogojih. Med pomanjkanjem hranil so bile najpogostejše tri tRNA polovice, in sicer ena 3’ in dve 5’ polovici. Izmed teh treh je samo 3’ polovica stimulirala sintezo proteinov med regeneracijo po stresu, in sicer tako da je olajšala vezavo mRNA na ribosom.

Plazmodij je praživalski parazit, ki povzroča malarijo. Odkriti so bili tRNA fragmenti s 5’ konca, 3’ konca in sredinskega dela starševske tRNA, 90 % teh fragmentov pa je nastalo iz tRNA, ki kodirajo le 8 različnih aminokislin, kar potrjuje teorijo, da ti fragmenti niso nastali po naključju. Raziskave so pokazale, da se med stresom poveča količina specifičnih tRF, kar kaže na njihovo vlogo pri odzivu na stres. Pomanjkanje hranil naj bi spodbudilo tudi diferenciacijo v gametocite. tRF iz Plasmodium falciparum so bili najdeni tudi v ekstracelularnih veziklih, ki so jih izločale okužene rdeče krvne celice. Ti vezikli naj bi svoj tovor prenesli do človeških endotelijskih celic. Vloga veziklov je medcelična komunikacija (interakcije med parazitom in gostiteljem), potencialno pa tudi vpliv na izražanje genov v gostiteljskih celicah.

Zaključek

tsRNA so evolucijsko zelo ohranjene nekodirajoče RNA, ki so prisotne v vseh treh domenah. Kljub temu so mehanizmi njihovega nastanka različni, endonukleaze, ki cepijo njihovo izvorno tRNA, pa niti niso nujno homologi. Za mnoge praživalske parazite so značilne menjave gostiteljev tekom njihovega življenjskega cikla, kar pa za je same parazite stresno. Stres kompenzirajo z akumuliranjem tsRNA, s katerimi lahko ob spremembah okoljskih pogojev regulirajo translacijo proteinov. S pomočjo veziklov lahko tsRNA izločajo v okolico, le ti pa tako lahko vstopajo v celice gostitelja in vplivajo na izražanje genov v njih. Nadaljnje raziskovanje vlog tsRNA v praživalskih parazitih bi lahko pripomoglo k zdravljenju okužb z njimi in izboljšalo naš vpogled v samo regulacijo celičnih procesov.

Viri

1. Avcilar-Kucukgoze I, Kashina A. Hijacking tRNAs From Translation: Regulatory Functions of tRNAs in Mammalian Cell Physiology. Frontiers in Molecular Biosciences. 2020;Volume 7-2020. https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2020.610617

2. Sharma M, Singh U. Role of tRNA-Derived Fragments in Protozoan Parasite Biology. Cells. 2025;14(2). doi:10.3390/cells14020115

3. Su Z, Wilson B, Kumar P, Dutta A. Noncanonical Roles of tRNAs: tRNA Fragments and Beyond. Annual Review of Genetics. 2020;54(Volume 54, 2020):47-69. doi:https://doi.org/10.1146/annurev-genet-022620-101840

4. Kumar P, Kuscu C, Dutta A. Biogenesis and Function of Transfer RNA-Related Fragments (tRFs). Trends in Biochemical Sciences. 2016;41(8):679-689. doi:10.1016/j.tibs.2016.05.004

5. PARA-SITE. https://parasite.org.au/para-site/contents/protozoa-intoduction.html