Metabolni inženiring

Izhodiščni članek:

Uvod

Industrijska fermentacija zahteva gojišča oz. medij, ki je sestavljen iz štirih glavnih komponent: vode, vira ogljika, vira dušika in mineralov oz. drugih dodatkov. Komponente gojišča morajo biti poceni, na voljo in dati čim večji izkoristek želenega produkta. Pogosti viri ogljika, ki se uporabljajo v industriji so glukoza, fruktoza, ksiloza, škrob... Pridobljeni so iz surovin, kot so ekstrakti rastlin (celuloza, lignoceluloza, hemiceluloza...), melase... Njihova pogosta uporaba povzroča 'tekmovanje' z drugimi industrijami (npr. prehrambena industrija) [1]. Dobra alternativa tem virom ogljika je acetat. Proizvedemo ga lahko ceneje in v velikih količinah, tako po kemijski kot biotehnološki poti. Acetat lahko pretvorimo v acetil koencim A, ki je substrat za Krebsov cikel. Kemikalije na osnovi acetata, ki so že v uporabi za te namene, so npr. aceton, izopropanol, sukcionat [2] ... V tem članku so razvili seve E. coli za proizvodnjo hidroksibutanona (acetoina) in 2,3-butandiola (2,3-BDO). Ti sevi kot edini vir ogljika uporabljajo acetat. 2,3-BDO ima direktne aplikacije: aditivi v prehrambeni industriji, sredstvo proti zamrzovanju; in indirektne aplikacije: pretvorba v metil etil keton (MEK) za sintetične barve, smole in ekstrakcijsko sredstvo [2, 3], ali 1,3-butadien za proizvodnjo gum v avtomobilski industriji [4]. Acetoin je pogosto uporabljen v kozmetični industriji in kot ojačevalec okusa v prehrambeni industriji zaradi maslenega okusa. Po pretvorbi acetata v acetil-CoA se ta vključi v Krebsov cikel. Malat, ki v tem ciklu nastane, se lahko pretvori v oksaloacetat ali pa v piruvat. Acetolaktat sintaza (BudB/alaS) poveže dve molekuli piruvata in tvori acetolaktat in CO2. Acetolaktat se z dekarboksilazo (BudA) cepi na še en CO2 in acetoin. Tako nastane eden izmed želenih produktov. Ta pa se lahko preko 2,3-BDO dehidrogenaze (BudC) reducira do 2,3-BDO. Ob tem pride do oksidacije NAD+. Kljub temu, da acetoin tehnično ni diol, pa se zaradi enostavnejšega poimenovanja in iste sintezne poti proces smatra kot sinteza diolov [2].

Izbira seva

Za produkcijo diolov so preizkusili dva seva E. coli: sev W (ATCC 9637), od tu naprej imenovan sev W in sev BL21 (DE3), od tu naprej imenovan sev BL21. Ker E. coli ne vsebuje genov za produkcijo diolov, so iz bakterije Enterobacter cloacae izolirali in vstavili gene budA, budB in budC. Zanimalo jih je, ali je vrstni red genov v operonu pomemben, zato so v plazmid vstavili gene v zaporedju budBAC, kot se pojavljajo v metabolni poti, in budCAB. Druga spremenljivka, ki so jo želeli preveriti, je bila število kopij plazmida. Vzeli so plazmid p5T7, ki ima nizko število kopij in pETDuet1, ki ima visoko število kopij. S temi kombinacijami so pripravili štiri različne seve E. coli, ki so bili sposobni sinteze 2,3-BDO iz glukoze. Glede na koncentracije proizvedenih diolov in izkoristke so ugotovili, da izbor seva E. coli, število kopij plazmida in zaporedje genov na operonu ne vplivajo na sintezo. Ko pa so medij z glukozo zamenjali z medijem z natrijevim acetatom (5 g/L), so ugotovili, da sev W proizvede do 10x več diolov od ostalih treh pripravljenih sevov. Za nadaljnjo analizo so torej uporabljali sev E. coli W_pET_bud-BAC (oz. sev W-BDO) [2].

Prekomerno izražanje genov

V E. coli obstajata dve poti pretvorbe acetata do acetil-CoA in sicer preko encimov AckA-Pta (acetat kinaza in fosfat acetiltransferaza) ali Acs (acetil-CoA sintetaza). Nastali acetil-CoA nato vstopa v Krebsov cikel, kjer se pretvori do citrata in izocitrata. Ta lahko gre naprej po normalni poti do α-ketoglutarata, ali pa preko t.i. glioksilatnega šunta do malata. Šunt promovirata izocitrat liaza (AceA) in malat sintaza (GlcB). Nastali malat se lahko po normalni poti pretvori do oksaloacetata ali pa se preko malat dehidrogenaz (MaeA in MaeB) pretvori do piruvata. Ta dva encima se razlikujeta po strukturi in regulaciji aktivnosti. MaeA je odvisen od NAD+ ali NADP+ medtem, ko je MaeB odvisen le od NADP+. Razlikujeta se tudi po reverzibilnosti reakcije. MaeA lahko katalizira reakcijo oksidativne dekarboksilacije malata ali reduktivne karboksilacije piruvata, MaeB pa reverzibilno bistveno manj aktiven. Glede na aktivnost posamezne reduktaze so ugotovili, da MaeA sodeluje bolj pri pretvorbi malata v piruvat, MaeB pa pri redukciji NADP+ v NADPH [5]. Glede na encime, ki sodelujejo v tej poti so pripravili še šest dodatnih sevov E. coli za analizo prekomernega izražanja posameznega ali večih genov hkrati. Izbrali so gene acs, ackA-pta, maeA, maeB, aceA in glcB, ki so jih vstavili v plazmid pCDF ter primerjali rast celic, privzem acetata in produkcijo diolov. Prvi modificirani sev so imenovali E. coli W-BDO-AC. Pripravili so ga tako, da so v E. coli W-BDO vstavili plazmid pCDF, ki je vseboval gene acs-aceA-glcB-maeA. Ugotovili so, da je bil privzem acetata večji pri sevu W-BDO-AC napram W-BDO. Da bi določili, kateri izmed izbranih encimov ima največjo vlogo pri tem, so pripravili še šest modificiranih sevov: AC1-6. Ugotovili so, da je bila rast celic bistveno počasnejša pri sevih s prekomernim izražanjem ackA-pta, kot pri tistih z acs. To lahko najverjetneje pripišemo vlogi acetil fosfata. Ta je namreč intermediat AckA-Pta poti, deluje pa tudi kot signalna molekula v večih procesih. Zaradi porabe acetil fosfata v namen pretvorbe do acetil-CoA lahko sklepamo, da ga ostane premalo za izvršitev ostalih nalog v celici, zato celica raste počasneje. Pri dodatnem prekomernem izražanju maeA so opazili povečano rast celic v obeh primerih (pri izražanju ackA-pta in acs), pri maeB pa le ob dodatnem prekomernem izražanju acs. Razlog je zopet v porabi acetil fosfata – tako MaeA kot MaeB delujeta bolje ob prisotnosti acetil fosfata. Pri privzemu acetata so ugotovili, da je hitrost privzema višja pri prekomernem izražanju ackA-pta. Razlog je v manjši porabi ATP, ko se acetat pretvori preko ackA-pta poti. Prekomerno izražanje malat dehidrogenaz ni signifikantno vplivalo na privzem acetata. Pri produkciji diolov so prav tako ugotovili, da je prekomerno izražanje ackA-pta favorizirano. Spet je razlog v nižji energiji AckA-Pta poti oz. v manjši porabi ATP. Glede na prekomerno izražanje malat dehidrogenaz pa so ugotovili, da so bile koncentracije proizvedenih diolov bistveno večje ob večjem delovanju MaeA. Eden izmed razlogov je v dejstvu, da je MaeB uporaben predvsem za redukcijo NADP+ [2]. V nekaterih študijah pa so ugotovili tudi, da acetil-CoA inhibira MaeB in temu podobne encime. Gre namreč za kompetitivno inhibicijo na fosfotransacetilazni domeni teh encimov. S tem lahko koncentracija acetil-CoA v celicah nadzira porazdelitev ogljika na piruvat/oksaloacetat [6].

Znižanje ravni izražanja genov

Drug pristop povečanja produkcije diolov na osnovi acetata je bilo znižanje ravni izražanja genov, ki negativno regulirajo metabolno pot acetata. Represor izocitrat liaze (IclR) vpliva na operon aceBAK, ki nadzoruje gene glioksilatnega šunta. Drug gen, katerega aktivnost so spreminjali je bil pka, ki kodira za peptidil-lizin N-acetiltransferazo. Ta acetilira lizin acetil-CoA sintetaze (acs) in s tem zavira njeno delovanje. Izvedli so delecijo enega ali obeh genov v sevih E. coli W-BDO in E. coli W-BDO-AC (šest različnih kombinacij). Delecije so sicer povečale privzem acetata, niso pa signifikantno povečale produkcije diolov, niti izkoristka reakcije. Privzeti acetat se očitno porabi drugje v celici ali pa zaide v drugo smer v biosintezni poti. Opazili so, da delecija gena pka vodi v statistično nižje izkoristke. Točnega razloga za to niso našli, so pa predpostavili, da je prišlo do inhibicije acs na drug način. V E. coli so namreč prisotne tudi manj specifične lizin acetiltransferaze. V tem delu eksperimentov so zaključili, da delecije genov, ki bi vplivale na metabolno pot acetata do piruvata, ne vplivajo na produkcijo diolov [2].

Zaključek

Edini večji problem, na katerega so naleteli je bila velika koncentracija proizvedenega CO2. Na en mol 2,3-BDO se namreč sintetizirajo štirje moli CO2. V bodoče bi bilo smiselno izboljšati sposobnost recikliranja CO2 ali pa izbrati možnost redukcije CO2 v format z vodikom. Slednja opcija je mogoča z encimoma hidrogenazo in format dehidrogenazo. Problem v tem procesu pa je občutljivost teh encimov na že zelo nizke koncentracije kisika – primerno le za anaerobne organizme. Možna rešitev bi bila modificirati te encime, da bi bili bolj primerni za uporabo v aerobnih pogojih in v sevu E. coli W-BDO-AC4 izboljšati tudi aktivnost hidrogenaze in format dehidrogenaze [2,7].

V študiji so želeli pripraviti sev E. coli, ki bi bil sposoben produkcije industrijsko pomembnih diolov acetoina in 2,3-BDO iz lažje pridobljenega vira ogljika – acetata. Končni koraki sinteze teh dveh so regulirani s strani encimov BudA, BudB in BudC. Gene za te encime so vstavili v E. coli sev W in dobili sev W-BDO. S prekomernim izražanjem genov za encime, ki sodelujejo v metabolni poti acetata in z delecijo genov za inhibitorje določenih encimov so dosegli višji izkoristek produkcije diolov. Končno so dobili sev W-BDO-AC4 (E. coli W_pET_budB-budA-budC − pCDF_ackA-pta-maeA), za katerega verjamejo, da bo uporaben v nadaljnjih raziskavah industrijske produkcije diolov [2].