PrymDetect

PrymDetect je iGEM projekt ekipe iz Krakova, ki je leta 2024 zasedel 2. mesto v kategoriji dodiplomcev.

Uvod in teoretično ozadje

Poleti 2022 je reka Odra, druga najdaljša reka na Poljskem, doživela eno največjih ekoloških katastrof v Evropi. Na stotine ton poginulih rib in drugih vodnih organizmov je bilo najdenih vzdolž 560 km reke. Sprva so bile vzroki nejasni, vendar so kasnejše analize pokazale, da je bil glavni krivec Prymnesium parvum, znan tudi kot "zlata alga".

Prymnesium parvum je enocelična mikroalga, dolga približno 5 do 10 mikrometrov. Gre za organizem, ki lahko sam proizvaja hrano s fotosintezo, hkrati pa deluje tudi kot plenilec in se heterotrofno prehranjuje z drugimi organizmi. V določenih pogojih Prymnesium proizvaja toksine, znane kot primnezini. Ti toksini uničujejo škrge vodnih organizmov ter prodirajo v njihov krvni obtok in notranje organe. Čeprav danes ob Odri ne opažajo več množičnih poginov, se je P. parvum trajno naselil v rečnem sistemu in njegova prisotnost ostaja težava. Tradicionalne metode zaznavanja so počasne, zahtevajo laboratorijsko opremo in usposobljeno osebje.

Cilj projekta

Cilj projekta PrymDetect je bil razviti preprost in dostopen test za hitro zaznavanje zlate alge neposredno na terenu. Test so nadgradili s 3D-natisnjeno napravo in programsko opremo za kvantitativno merjenje fluorescence s pomočjo kamere mobilnega telefona. Poleg tega so želeli z razvojem odprte platforme olajšati izdelavo podobnih testov. Prizadevali so si tudi za ozaveščanje javnosti o nevarnostih razrasta zlate alge ter vključevanje lokalnih skupnosti v iskanje rešitev za zaščito vodnih ekosistemov.

SHERLOCK detekcija P. parvum

V projektu so uporabili metodo SHERLOCK (angl. Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) za zaznavanje Prymnesium parvum v vzorcih vode. SHERLOCK izkorišča lastnosti proteina Cas13a. Ta protein se s pomočjo crRNA z visoko specifičnostjo usmeri na točno določeno zaporedje. Molekula crRNA je sestavljena iz zaporedja DR (angl. direct repeat) in vmesnika, ki je komplementaren tarči. Pri sintezi crRNA so pred zaporedje dodali T7 promotor. Ko se Cas13a veže na genetski material organizma, se aktivira njegova »kolateralna« RNazna aktivnost, kar pomeni, da nespecifično razgrajuje bližnje enoverižne RNA molekule. To aktivnost so izkoristili tako, da so v reakcijsko zmes vključili sintetične RNA sonde, označene s fluorescenčnim označevalcem in dušilcem signala. Če so zaznali fluorescenčni signal, to kaže na prisotnost ciljne DNA v vzorcu.

Najprej so po odvzemu vzorca vode izolirali DNA organizma z uporabo kompleta za izolacijo genomske DNA. Nato so za povečanje signala ciljne DNA uporabili pomnoževanje z rekombinazo in polimerazo (RPA). Pri RPA rekombinaze pomagajo stabilizirati vez med primerji in DNA, kar omogoča, da se reakcija uspešno izvaja že pri temperaturah pod 37 °C. Nato so v reakcijsko mešanico dodali vse komponente za SHERLOCK reakcijo, vključno s T7 RNA polimerazo. Ta korak aktivira kompleks crRNA:Cas13a, pri čemer aktivirani Cas13a protein začne razgrajevati RNA sonde v mešanici.

Zasnova in optimizacija komponent

Za programiranje sistema, ki cilja na specifično regijo genoma P. parvum, je ekipa morala oblikovati učinkovito kombinacijo RPA primerjev in crRNA molekule. Izbrali so regijo genoma ITS2 (angl. internal transcribed spacer 2), ki se pogosto uporablja za identifikacijo vrst zaradi svoje variabilnosti med vrstami in ohranjenosti znotraj vrste. Pripravili so dve začetni crRNA zaporedji: PrymCrRNA1 (BBa_K5087022) ter PrymCrRNA2 (BBa_K5087023). Določili so tudi tri pare primerjev (Gal, Mod in Alt), pri čemer so nekatere prilagodili iz obstoječe literature, druge pa zasnovali sami. Z združitvijo teh parov in dveh crRNA zaporedij so imeli na voljo 18 možnih kombinacij SHERLOCK komponent za nadaljnje testiranje. Ekipa je preverila delovanje vseh kombinacij, pri čemer so uporabili tako fluorescenčno metodo kot tudi test z lateralnim tokom (LFA). Najuspešnejša kombinacija je bil par ModF-ModR + PrymCrRNA1, saj je dosegla visoko fluorescenčno intenziteto tako pri koncentraciji 530 nM kot tudi pri 200 fM. Ekipa si je nato prizadevala dodatno optimizirati sistem. Izvedli so fluorescenčne teste, v katerih so ocenili vse kombinacije znotraj istega eksperimenta, da bi jih lahko neposredno primerjali med seboj. Cilj tega testa je bil ugotoviti, ali bi mešanje različnih primerjev (smerni in protismerni) ter različnih crRNA zaporedij lahko omogočilo nižjo mejo zaznavanja. Najbolje se je izkazala kombinacija ModF-GalR + PrymCrRNA1, saj je dosegla visoke fluorescenčne signale tako pri 480 nM kot tudi pri 200 fM koncentraciji ciljne DNA.

Kvantifikacija sistema

Naslednji korak je bila kvantifikacija sistema SHERLOCK, da bi preverili, ali fluorescenčni signal ustreza količini ciljne DNA P. parvum. Mejo zaznavanja (LOD) so definirali kot najnižjo koncentracijo PCR-pomnožene DNA, ki še vedno daje pozitiven rezultat, kar se kaže kot statistično pomembno povečanje fluorescence skozi čas. Vendar se je izkazalo, da je bila reakcija SHERLOCK težko ponovljiva. Različne jakosti fluorescence so bile opažene tudi pri vzorcih iz iste RPA reakcije, prav tako pa so se meje zaznavanja razlikovale med ponovitvami testa. Ta nedoslednost je onemogočila zanesljivo primerjavo rezultatov med posameznimi eksperimenti. Kljub prizadevanjem za optimizacijo koncentracije RPA primerjev ni bilo mogoče določiti razpona koncentracij ciljne DNA, ki bi bil sorazmeren s končno intenzivnostjo fluorescence. Na podlagi teh ugotovitev se je izkazalo, da test ni primeren za kvantitativne meritve, temveč predvsem za kvalitativno zaznavanje prisotnosti tarče. Kljub prej omenjenim težavam z doslednostjo rezultatov je ekipa na podlagi zbranih podatkov zaključila, da je meja zaznavanja (LOD) njihovega testa 1 pM. Ta koncentracija ustreza približno 50 milijardam celic P. parvum na liter vode.

Gojenje P. parvum

Prymnesium parvum ni modelni organizem, zato zanj ne obstajajo uveljavljeni protokoli za gojenje v laboratorijskih pogojih. Ekipa je zato razvila lastno metodo za vzdrževanje kulture P. parvum v laboratoriju. Poleg tega so preizkusili različne tehnike izolacije DNA iz vzorcev te alge. Ugotovili so, da je izolacija z uporabo NEB kompleta dala nekoliko višjo koncentracijo DNA v primerjavi s kompletom QIAGEN. Poleg boljše učinkovitosti se je NEB komplet izkazal tudi za bolj priročnega, saj ni zahteval dolgotrajne začetne inkubacije, ki pri QIAGEN metodi traja od 5 do 7 ur.

PrymFlow

Ekipa je razvila tudi PrymFlow, test z lateralnim tokom (LFA), primeren za uporabo na terenu brez potrebe po fluorimetrični opremi. Uporabili so RNA sonde, ki so na enem koncu označene s 6-karboksifluoresceinom (FAM), na drugem pa z biotinom. T-linija označuje pozitiven rezultat, C-linija pa deluje kot kontrola, ki postaja manj izrazita, ko je v vzorcu več tarčnega zaporedja. Testi so pokazali, da inkubacija s telesno toploto in termopomnoževalnikom dajeta primerljive rezultate.

SynLOCK

Številne vrste alg imajo lahko negativne učinke na okolje, pri čemer se posamezni sevi genetsko razlikujejo, zato je nujno razvijati hitre in prilagodljive diagnostične metode za njihovo zaznavanje. Zato so razvili platformo SynLOCK – sistem za sintezo crRNA za uporabo s SHERLOCK. Tako morajo znanstveniki oblikovati le še zaporedje vmesnika, ki je specifično za tarčo, ki jo želijo zaznati.

Za izpolnitev ciljev projekta so člani ekipe najprej zasnovali t. i. SynLOCK kaseto (BBa_K5087017). Kaseta že vsebuje T7 promotor za in vitro transkripcijo ter DR zaporedje, ki je združljivo s Cas13a proteinom. Kasneje so dodali še reportersko enoto (vijolični kromoprotein), ki so jo umestili med restrikcijski mesti SapI. To omogoča enostavno vstavljanje prilagojenih vmesnikov s pomočjo SapI encima ter vizualno selekcijo kolonij, ki so uspešno privzele novo zaporedje. Kot ogrodje so izbrali plazmid pSB1C3, saj je to standardni vektor za shranjevanje BioBrick delov. Nato so sestavili celotno kaseto skupaj z reporterjem in jo prenesli v plazmid pSB1C3. V naslednjem koraku so vanjo klonirali prilagojene crRNA vmesnike, uporabljene v testu PrymDetect. Funkcionalnost sistema so potrdili z in vitro transkripcijo in elektroforezo RNA. Poleg tega so preverili prenosljivost SynLOCK kasete med različnimi plazmidnimi ogrodji.

PrymChip

Ekipa je želela razviti tudi dostopno, terensko uporabno testiranje okoljskih vzorcev, ki posameznikom omogoča testiranje vzorcev vode neposredno ob vodnih virih. Rezultat tega dela je PrymChip, 3D-natisnjena naprava za zaznavanje in kvantifikacijo zelene fluorescenčne svetlobe. Vse dele naprave so uspešno oblikovali v programu TinkerCAD in jih natisnili s tehnologijo FDM (angl. fused deposition modeling). Zaradi časovne omejenosti in pomanjkanja reagentov ekipi ni uspelo demonstrirati zaznavanja alg s pomočjo SHERLOCK metode. Kljub temu so uspešno izvedli eksperiment s fluoresceinom, kar je potrdilo funkcionalnost naprave. Rezultati so pokazali, da programska oprema natančno analizira fotografije in poda rezultate, ki dobro ustrezajo dejanskim vrednostim koncentracije fluoresceina. To dokazuje, da je programska oprema učinkovita in zanesljiva, pri čemer pa je občutljivost meritve močno odvisna od kakovosti kamere pametnega telefona.

Zaključek

Projekt PrymDetect predstavlja celostno rešitev za zaznavanje mikroalge Prymnesium parvum, ki lahko povzroča obsežno okoljsko škodo. S povezovanjem sodobnih pristopov sintetične biologije, kot je SHERLOCK ter z inženirskimi rešitvami, kot sta PrymFlow in PrymChip, je ekipa razvila sistem, ki je hkrati dostopen, prenosljiv in prilagodljiv. Pomemben prispevek projekta je tudi SynLOCK, standardiziran sistem za sintezo crRNA, ki močno olajša pripravo testov tudi za druge organizme. Projekt zato ne rešuje zgolj enega lokalnega problema, temveč ustvarja osnovo za širšo uporabo v okoljski diagnostiki in podporo prihodnjim iGEM ekipam. Čeprav je pri nekaterih komponentah, kot je kvantitativna analiza fluorescence, potrebna nadaljnja optimizacija, so doseženi rezultati trden dokaz koncepta.

Viri in literatura

[1] PrymDetect: Can SHERLOCK outsmart the Golden Algae? https://2024.igem.wiki/ju-krakow/index.html