Agregati RNP pri nevrodegenerativnih boleznih

Uvod

Fazna separacija tekoče-tekoče (LLPS) je reverzibilen in dinamičen biološko pomemben fizikalni pojav nastajanja koloidov iz homogenih raztopin. S pomočjo nje se tvori večina brezmembranskih celičnih organelov, oz. tako imenovanih biomolekularnih kondenzatov, kot so na primer jedrce, Cajalova telesca, ali stresne granule.

Pri LLPS pride do ločitve začetne raztopine v razredčeno in gosto fazo, pri čemer je gosta faza lahko več desetkrat bolj koncentrirana in tvori emulzijske kapljice. Meni se, da lahko vsi biopolimeri tvorijo takšne faze, vendar so pogoji, pod katerimi pride do LLPS, značilno različni za vsak sistem. Najbolj pomembna lastnost proteinov, ki se fazno ločujejo tudi pri majhnih koncentracijah, je večvalenca. Večvalenca je predvsem značilnost fleksibilnih neurejenih regij proteina, na katere se lahko veže več kopij istega ali različnega proteina oz. nukleinske kisline, zaradi česar lažje pride do fazne separacije in posledično agregacije.

Vendar je LLPS zelo pomembna za normalne metabolične funkcije, pogosto je tudi vzrok nastanka proteinopatov. Zaradi zunanjega stresa ali mutacijskih sprememb, gosta faza nastala pri LLPS lahko “stari”, kar pomeni, da ji se spremeni dinamika v bolj togo stanje, kot je gel ali amiloidni fibril. V zadnjih letih so ključne raziskave povezale ta proces agregacije s številnimi nevrodegenerativnimi bolezni, kot so amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD).

Ključni RNA-vezavni proteini, ki so povezani z razvojem teh bolezni, vključujejo FUS in TDP-43.

FUS

Vloga v celici

Fused in sarcoma (FUS), včasih Translocated in sarcoma (TLS), je heterogeni jedrski ribonukleoprotein (hnRNP). Nahaja se predvsem v jedru, kjer ima pomembno vlogo pri transkripciji, translaciji, transportu in procesiranju RNA ter popravku napak na DNA. FUS, za razliko od večine drugih podobnih proteinov, pod določenimi pogoji lahko translocira iz jedra v citoplazmo in se kopiči v fibrilarne agregate.

Zgradba

FUS ima 526 aminokislinskih ostankov, razporejenih v tri glavne domene. Vsebuje dve urejeni regiji za vezavo nukleinskih kislin, RNA prepoznavni motiv (RRM) in cinkov prst (ZnF). Več kot 70 odstotkov FUS pa sestavljajo neurejene regije (IDR). Zanje je značilna odsotnost velikih hidrofobnih ostankov, zaradi česar niso del sekundarnih struktur, temveč so precej fleksibilni. V N-terminalni domeni (NTD) se nahaja prionu podobna regija (PLD), ki je bogata z glutaminom, glicinom, serinom in treoninom. Protein vsebuje pa tudi 3 RG/RGG-bogate neurejene regije.

LLPS in agregacija

V odsotnosti nukleinskih kislin ima le prionu podobna regija (PLD) N-terminalne domene inherentne lastnosti fazne separacije. Ta lahko polimerizira v obliki nepatogenih homogenih amiloidnih fibrilov. Raziskave so pa pokazale, da je RRM, s svojimi velikimi hidrofobičnimi ostanki, tista regija ki je ključna za nastanek toksičnih agregatov. FUS RRM lahko polimerizira v nativnih pogojih v prisotnosti nukleinske kisline, pri čemer pride do dinamičnega odprtja strukture in intramolekularnih interakcij preko osrednjih beta-trakov.

Do nepravilne fazne separacije FUS proteina lahko vodijo različne patogene mutacije, predvsem znutraj PLD, kot je za FTD značilna G156E, in tudi nekatere posttranslacijske modifikacije. Na primer raziskave so pokazale, da ko argininski ostanki proteina niso metilirani, pride do močnejših interakcij med njimi in aromatskimi aminokislinskimi ostanki, kar povzroči izrazitejšo kondenzacijo.

Možni zaviralci nastajanja toksičnih fibrilov vključujejo ATP, ki se lahko veže na RRM in s tem zvišja kinetično bariero fazne separacije, ter fosforilacija PLD, za katero se je iskazalo, da zmanjšuje toksičnost te domene ter pozitivno spremeni dinamiko LLPS.

TDP-43

TAR-DNA-binding protein 43 spada v skupino heterogenih jedrnih ribonukleoproteinov (hnRNP). Prvič je bil identificiran kot protein, ki veže TAR DNA pri virusu HIV in zavira prepis DNA. Ta protein se pretežno nahaja v jedrih živčnih celic, a je zmožen preiti tudi v citoplazmo. V jedru je običajno vezan na RNA ali DNA, pri čemer ima večjo afiniteto do RNA.

Vloga v celici

TDP-43 je vključen v številne procese v celici, predvsem v metabolizem RNA. Sodeluje pri transkripciji, izrezovanju intronov (splicing) in stabilizaciji mRNA. Veže lahko več tisoč različnih RNA molekul. S faznim prehodom tekoče-tekoče pa lahko sodeluje pri tvorbi stresnih granul in drugih biomolekulskih kondenzatov, ki so ključni za odziv na stres v celicah in metabolizem RNA. Prav tako je pomemben pri nekaterih načinih popravljanja dvojnih prelomov DNA.

Zgradba

TDP-43 ima 414 aminokislinskih ostankov in je razdeljen na štiri domene.

NTD: N-končna domena (NTD), ki je pomembna za polimerizacijo. Prek te domene se tvorijo funkcionalni dimeri oziroma oligomeri v celicah. Različni polimeri pa omogočajo izrezovanje intronov pri molekulah pre-mRNA.

RRM1 in RRM2: Dva RNA prepoznavna motiva, ki sta potrebna za vezavo RNA oz. DNA. Omogoča vezavo na zaporedja s ponovitvami UG ali TG na 3’-UTR regiji mRNA oz. DNA.

CTD: C-končna domena (CTD) je domena značilna za prione oz. prion-like domain (PLD). Ta domena ima neurejeno zgradbo (IDR), kar pomeni da je precej fleksibilna. Na skrajnem koncu CTD je regija bogata z glicini in pred tem za prione značilna regija bogata z glutamini in asparagini (Q/N domena). Skoraj vse mutacije značine za razvoj ALS se zgodijo prav v tej domeni, zato je ta domena zelo pomembna pri patogenezi TDP-43.

TDP-43 spreminja svojo konformacijo med “odprto” in “zaprto” obliko. V zaprti konformaciji so prisotne šibke interakcije med domenami, v odprti pa lahko veže ligand. To mu omogoča opravljanje njegovih funkcij (odprta) in zmanjšuje nastajanje apregatov (zaprta).

LLPS in agregacija

Prisotnost PLD je glavni gonilec LLPS pri TDP-43. V odprti konformaciji se lahko povežejo domene več monomerov in se lahko tako tvorijo kapljice. Regulacija LLPS poteka z ATP in RNA. Visoke koncentracije RNA v jedru onemogočajo nastanek agregatov. TDP-43 tvori interakcije z RNA preko dveh z argininom in lizinom bogatih regij v CTD, ter z RRM1 in RRM2. Na RRM1 in RRM2 se lahko veže tudi ATP in s tem prepreči agregacijo. ATP se veže tudi na NTD in omogoča funkcionalno oligomerizacijo. Z leti se zmanjša koncentracija ATP, kar vodi v monomerizacijo in izhod iz jedra ter možnost nastanka agregata v citoplazmi. Pojav agregatov je zato bolj pogost pri starejših osebah. Nastanek agregatov pa vodi v uničenje živčnih celic in razvoj patoloških simptomov.

Zaključek

LLPS je pomemben celični mehanizem, ki ga je potrebno dobro razumeti, da bi lahko razvili učinkovita zdravila za nevrodegenerativne bolezni, saj so kapljice, ki nastanejo, vmesni korak do nastanka agregatov. Kot tarče učinkovin pa bi lahko uporabili ravno proteine kot sta FUS in TDP-43, saj bi lahko z regulacijo teh proteinov vplivali na zmanjšanje pojava oz. uničenje agregatov. Druge možne tarče za razvoj učinkovin so še encimi, ki omogočajo posttranslacijske modifikacije proteinov v agregatih ter razvoj majhnih molekul, ki bi delovale kot inhibitorji ali pa analogi ATP,ki bi tako onemogočile nastanek agregata.