Nastanek, sestava in delovanje stresnih granul

Uvod

Stresne granule (SG) so brezmembranski ribonukleoproteinski delci (RNP), ki jih najdemo v citosolu evkariontskih celic. Večinoma so zgrajene iz mRNA molekul, katerih translacija je bila preprečena. Vsebujejo tudi številne iniciacijske faktorje, RNA-vezavne proteine (RBP) ter proteine, ki se na RNA ne vežejo. Pomembne so, ker vplivajo na lokalizacijo in translacijo mRNA molekul, prav tako pa lahko mutacije, ki povečajo njihovo izražanje povzročijo nekatere nevrodegenerativne bolezni[1].

Do oblikovanja stresnih granul pride zaradi povečane količine prostih neprevavajočih se mRNA molekul v citosolu, kar je večinoma povezano s prisotnostjo stresa v okolju celice. Stres lahko povzročijo radiacija, zdravila ali druge kemijske spojine, virusne infekcije, pomanjkanje hranil … Te različne stresne situacije večinoma vodijo v celostno reprogramiranje izražanja genov, saj na splošno inhibirajo translacijo, povečajo pa translacijo tistih mRNA, katerih nastali proteini omogočajo prilagajanje na stres[2].

Sestava

Zgradba stresnih granul je kompleksna in precej raznolika, saj je odvisna od pogojev nastanka. Sestavljene so iz dveh plasti, v notranjosti je del z večjo koncentracijo proteinov in mRNA, okrog pa manj koncentriran in dinamičen ovoj. Proteini v granulah so raznoliki, približno 50% vseh proteinov se veže na RNA, ostali pa se na RNA ne vežejo, ampak so na primer encimi, ki uvajajo posttranslacijske modifikacije ali metabolični encimi. V granulah so lahko prisotne tudi nekatere glavne komponente signalnih poti, kar kaže na to, da lahko oblikovanje stresnih granul spremeni signalizacijo. Granule so dinamične strukture, ki se v celici lahko zlivajo in premikajo po citosolu. Ko opravijo svojo nalogo, jih celica razgradi z avtofagijo ali pa razpadejo, kar omogoča, da se mRNA molekule lahko ponovno prevajajo[1].

mRNA v stresnih granulah

Za oblikovanje SG so ključnega pomena tudi mRNA molekule, ki predstavljajo kar 78-90% stresnih granul. V prisotnosti stresa se zaradi velike količine prostih mRNA povečajo RNA-RNA interakcije, kar dodatno spodbuja njihovo kondenzacijo v granule. Kljub temu da so v stresnih granulah opazili veliko različnih mRNA molekul, so ugotovili, da je v večjih količinah prisotnih le okrog 10% vrst celotne celične mRNA. To kaže, da SG ne vplivajo na translacijo v celicah globalno, temveč bolj specifično na tiste mRNA, ki agregirajo v stresnih granulah. Prav tako so odkrili, da so mRNA molekule, ki se nahajajo v SG večinoma daljše in imajo manjšo translacijsko učinkovitost[2].

Posttranslacijske modifikacije mRNA v stresnih granulah

Na sortiranje mRNA v obdobjih stresa vplivajo tudi specifične kemijske modifikacije njihovih baz. Med njimi je najpogostejša in najpomembnejša modifikacija m6A. mRNA z m6A modifikacijo prepozna YTHDF, ki se s svojo YTH domeno veže na m6A. YTHDF ob prisotnosti m6A zviša učinkovitost translacije ter vsebuje zaporedja z nizko kompleksnostjo, kar omogoča fazno ločevanje v SG. Ker je fazno ločevanje bistveno okrepljeno ob prisotnosti mRNA, ki vsebuje več m6A modifikacij, se ob stresu, ko je translacija ustavljena, lahko povezava YTHDF z mRNA olajša nastanek SG[2].

Nastanek kanoničnih in nekanoničnih stresnih granul

SG lahko nastanejo po dveh glavnih poteh – kot kanonične ali nekanonične SG.

Kanonične stresne granule

Kanonične SG se najpogosteje tvorijo kot posledica fosforilacije eIF2α, ki je del ternarnega kompleksa (eIF2.GTP.Met-tRNAᵢMet), ključnega za iniciacijo translacije. Fosforilacija eIF2α na serinu 51, ki jo sprožijo zaradi stresa aktivirane kinaze, povzroči nastanek nefunkcionalnega ternarnega kompleksa. Posledično se tvorijo nefunkcionalni 43S in 48S kompleksi, ki se ne morejo pretvoriti v aktivni 80S kompleks. To vodi v kopičenje zastalih 48S kompleksov, kar povzroči, da ribosomom zmanjka mRNA. Ker ti zastali kompleksi predstavljajo eno izmed komponent SG, skupaj z RBP-ji, ki omogočajo nukleacijo, povzročijo nastanek SG. Poleg tega lahko fosforiliran eIF2α povzroči tudi odpadanje ribosomov iz mRNA med elongacijo, kar poveča količino prostih, neprevedenih mRNA, ki dodatno prispevajo k tvorbi SG. Kanonične SG pa lahko nastanejo tudi neodvisno od fosforilacije eIF2α, če pride do inhibicije tvorbe ternarnega kompleksa z drugimi mehanizmi[2].

Nekanonične stresne granule

Nekanonične oziroma atipične SG nastanejo neodvisno od eIF2α in so posledica sprememb v kompleksu eIF4F, ki sodeluje pri začetku translacije z vezavo na 5’ kapo mRNA. Kompleks eIF4F sestavljajo eIF4E (omogoča vezavo na kapo), eIF4A (odvije sekundarne strukture na 5' neprevajajoči regiji mRNA) in ogrodni eIF4G. Čeprav vsi trije iniciacijski faktorji sodelujejo pri iniciaciji translacije, imajo med stresom različne vloge pri regulaciji SG. Medtem ko eIF4E in eIF4G spodbujata nastanek SG, eIF4A deluje ravno nasprotno, saj s svojo helikazno aktivnostjo preprečuje kondenzacijo RNA. Zanimivo je, da lahko določeni inhibitorji spremenijo funkcijo eIF4A tako, da ta stabilno veže mRNA in s tem prepreči skeniranje 40S podenote, kar vodi v blokado iniciacije in nastanek SG[2].

Vloga G3BP v stresnih granulah

Pomembno vlogo pri nukleaciji SG ima tudi protein G3BP – RBP, ki omogoča fazno separacijo in tvorbo kondenzatov[2]. Z dimerizacijo prek N-končne domene tvori homodimere. Intrinzično neurejeno regijo, ki sledi dimerizacijski domeni, lahko razdelimo na dva dela: IDR1, močno negativno nabito in zelo kislo regijo, ter IDR2, ki je rahlo pozitivno nabita. Na C-koncu proteina najdemo domeno za vezavo na RNA, sestavljeno iz stabilnega RNA-prepoznavnega motiva in neurejene regije IDR3, ki je prav tako pozitivno nabita. Pri nizkih koncentracijah RNA prevladujejo intramolekularne interakcije med IDR1 in IDR3, kar predstavlja zaprto konformacijo homodimera. Ob povišani koncentraciji RNA ta izpodrine IDR1 in se veže na IDR3, kar povzroči, da homodimer preide v odprto konformacijo, ki omogoča fazno separacijo[3]. G3BP prav tako spodbuja kondenzacijo neprevedenih RNP-jev posredno prek inaktivacije eIF4A[2].

Vloga hipofosforiliranega 4EBP1 pri nastanku stresnih granul

Nekanonične SG se pogosto tvorijo ob stresih, kot so hipoksija, pomanjkanje ATP ali ob okužbi s poliovirusom prek inaktivacije mTORC1 kinaze, kar vodi do kopičenja hipofosforiliranega 4EBP1. Ta tekmuje z eIF4G za vezavo na eIF4E, kar zmanjša tvorbo aktivnega eIF4F kompleksa, posledično pa nastanejo SG. Znižana raven ATP dodatno zmanjša vezavo eIF4A na RNA, kar spodbuja kondenzacijo RNA. Medtem ko hipofosforilacija 4EBP1 spodbuja nastanek nekanoničnih SG, pa hkrati s svojim vplivom na stabilnost eIF4F posredno vpliva na zmanjšan nastanek kanoničnih SG[2].

Vloga stresnih granul pri translaciji

Vloga stresnih granul pri regulaciji translacije še vedno ni popolnoma razjasnjena. Številne študije potrjujejo, da SG delujejo kot mesta za časovno regulacijo inhibicije translacije določenih mRNA. Novejše študije na celicah brez proteina G3BP pa kažejo, da se globalna inhibicija translacije zgodi tudi v odsotnosti granul, kar odpira vprašanje, če sta tvorba SG in translacijska represija morda ločena procesa[2].

Časovna regulacija translacije

Primer časovne regulacije SG je bil opažen pri inhibitornih imunskih kontrolnih točkah T-limfocitov ki se, ko se kopičijo v SG ne prevajajo, prevajati in izražati pa se začnejo, ko se SG razgradijo[4]. Nasprotno se proteini toplotnega šoka (Hsp) med stresom ne kopičijo v granulah, kar jim omogoča, da se takrat lahko prevajajo. Kljub temu da proteini toplotnega šoka ne agregirajo s proteinom G3BP1, ta vseeno vpliva na regulacijo njihove translacije. G3BP1 deluje kot translacijski represor za Hsp, njegova odsotnost pa vodi v močno povečano ekspresijo Hsp. SG lahko na translacijo Hsp vplivajo tudi tako, da ujamejo proteine, ki bi sicer spodbujali translacijo Hsp. Stresne granule v primeru aktivacijskega transkripcijskega faktorja 4 (ATF4) preprečujejo prekomerno izražanje ATF4 tako, da se del ATF4 med stresom shrani v SG. Del, ki se shrani v SG naj bi bil del z m6A modifikacijo. Mehanizem metilacije in demetilacije v povezavi z agregacijo v SG bi lahko bil ključen za celično uravnavanje ravni ATF4 med stresom[2].

Skupki znotraj stresnih granul

Translacijo, stabilnost in modifikacije mRNA bi lahko neodvisno uravnavali RNP kompleksi, ki se nahajajo v ločenih skupkih znotraj SG. Mehanizem, po katerem se mRNA usmerjajo v različne skupke znotraj SG, bi lahko bil povezan z m6A modifikacijami. Kot že omenjeno, pri razvrščanju mRNA v granule sodelujeta proteina YTHDF3 in G3BP1. Prvi prepozna m6A modifikacijo, drugi pa veže nemodificirano mRNA. m6A-nemodificirana mRNA se tako poveže s proteinom G3BP1 v jedru stresne granule, medtem ko se m6A -modificirana mRNA v skupke združi s proteinom YTHDF3 in se nahajajo v bolj dinamičnem ovoju SG[2].

Translacija znotraj granul

Z metodami, ki omogočajo opazovanje translacije in vivo so ugotovili, da znotraj SG poteka tudi določena stopnja translacije, kar je v nasprotju s prepričanjem, da so SG območja brez kakršnekoli translacijske aktivnosti. Velika večina mRNA v SG je dejansko translacijsko utišana, 1 do 2% molekul mRNA pa ohranja signal nastajajočih peptidnih verig. V SG se lahko prevaja tako mRNA, katere translacija je med stresom v citoplazmi povečana, kot tudi mRNA, katerih proteini se med stresom nizko izražajo. Glede na rezultate teh raziskav okolje SG ni popolnoma neprepustno za ribosome, ampak se lahko v SG povežejo tudi mRNA, ki so še vedno vezane na polisome[2].

Zaključek

Razumevanje mehanizmov nastajanja stresnih granul in njihovega vpliva na translacijo je pomembno tudi za razvoj novih terapevtskih pristopov, saj tarčno usmerjanje komponent SG, predvsem G3BP1[5], predstavlja obetavno možnost za razvoj načinov zdravljenja nevrodegenerativnih bolezni in raka.

Viri

[1] D. S. W. Protter, R. Parker: Principles and Properties of Stress Granules. Trends in Cell Biology 2016, 26, 668–679. DOI: 10.1016/j.tcb.2016.05.004

[2] P. Adjibade, R. Mazroui: Stress granules: stress-induced cytoplasmic mRNPs compartments linked to mRNA translational regulatory pathways. Front. RNA Res. 2023, 1, 1226610. DOI: 10.3389/frnar.2023.1226610

[3] P. Yang, C. Mathieu, R.-M. Kolaitis, P. Zhang, J. Messing, U. Yurtsever, Z. Yang, J. Wu, Y. Li, Q. Pan idr.: G3BP1 Is a Tunable Switch that Triggers Phase Separation to Assemble Stress Granules. Cell 2020, 181, 325-345.e28. DOI: 10.1016/j.cell.2020.03.046

[4] D.-M. Franchini, O. Lanvin, M. Tosolini, E. Patras De Campaigno, A. Cammas, S. Péricart, C.-M. Scarlata, M. Lebras, C. Rossi, L. Ligat idr.: Microtubule-Driven Stress Granule Dynamics Regulate Inhibitory Immune Checkpoint Expression in T Cells. Cell Reports 2019, 26, 94-107.e7. DOI: 10.1016/j.celrep.2018.12.014

[5] H. Zhou, J. Luo, K. Mou, L. Peng, X. Li, Y. Lei, J. Wang, S. Lin, Y. Luo, L. Xiang: Stress granules: functions and mechanisms in cancer. Cell Biosci 2023, 13, 86. DOI: 10.1186/s13578-023-01030-6