Telomerazni RNP pri kvasovki

Uvod

Telomere so zaščitni konci kromosomov, ki preprečujejo obrabo DNA, izgubo genetskega materiala in združevanje kromosomskih koncev. V somatskih celicah se telomerna DNA skrajša zaradi nepopolne replikacije zastajajoče verige in poškodb DNA. V matičnih in rakavih celicah ter pri mnogih enoceličnih evkariontih, kot so kvasovke, telomerazni RNP kompleks vzdržuje dolžino telomer. Pri brstečih kvasovkah telomeraza uporablja Tlc1 RNA kot matrico. Tlc1 RNA je 1158 nukleotidov dolga RNA, ki jo prepisuje RNA polimeraza II. Njen nastanek je reguliran s pomočjo celičnega cikla. Prepisuje se na prehodu iz G v S fazo v majhnih količinah.

Tlc1 RNA prehaja več stopenj obdelave in transporta, vključno z prehajanjem med jedrom in citoplazmo, modifikacijami na 5’ in 3’ koncu ter asociacijami s proteini, kar je ključno za stabilnost in funkcijo. Nekatere lastnosti ima enake kot snRNA, snoRNA in mRNA, vendar pa ima svojo unikatno pot zorenja. Razumevanje biogeneze Tlc1 RNA je ključno za spoznanje funkcije telomeraze in njene regulacije pri podaljševanju telomer.

Stabilizacija koncev in transport v citoplazmo

Tlc1 RNA je ena izmed najbolj stabilnih RNA v celicah brstečih kvasovk. Ima zelo dolgo razpolovno dobo za katero so odgovorni številni stabilizacijski mehanizmi. Na 5'-konec se metilira 7-metilgvanozinska (m7G) kapa, ko-transkripcijsko se vežeta tudi CBC (Cap-Binding Complex) ter TREX-1 (Transcription-Export 1) kompleksa. CBC je pri kvasovkah sestavljen iz Sto1 in Cbc2 podenot. Za transport sta ključni interakciji CBC z Mex67 (jedrni eksportni faktor) in eksportinom 1 (Xpo1), ki pripomoreta k prenosu RNA molekul skozi jedrne pore v citoplazmo. Xpo1 omogoča prehod skozi jedrne pore, medtem ko Mex67 tvori heterodimerni kompleks z Mtr2 ter stabilizira 3'-konec Tlc1 že pred začetkom transporta.

V primeru odsotnosti ali pomanjkanja Mex67 se Tlc1 RNA razgradi v jedrnem eksosomu. Stabilizacija in preprečevanje razgradnje s pomočjo Mex67/Mtr2 kompleksa še ni popolnoma znana, vendar najbrž poteka s pomočjo interakcij z kompleksom TREX-1. Ta omogoča koordinacijo nadaljnje transkripcije, nastanek zrele oblike RNA ter vezavo Mex67/Mtr2.

Xpo1 se ni sposoben vezati na RNA in za prenos molekul potrebuje adapterski protein. Pri mnogoceličarjih ima to vlogo PHAX (Phosphorylated adaptor for RNA export), katerega homologa pri kvasnih celicah ne poznamo. Vlogo adapterja prevzame kompleks Mex67/Mtr2, ki tako deluje tudi kot RNA šaperon ter hkrati pripomore k stabilizaciji in transportu.

V citoplazmi se RNP disociira stran od Mex67-Xpo1 proteinov ter TREX-1 kompleksa. 3'-konec stabilizira vezava Sm7 (heptamerni proteinski kompleks), brez katerega bi se RNA v citoplazmi razgradila. Oba, Mex67/Mtr2 kompleks in Sm7 stabilizirata Tlc1 RNA na 3'-koncu – Mex67/Mtr2 usmeri Tlc1 v eksonuklearni transport in ga stabilizira pred samim transportom, Sm7 pa Tlc1 RNA stabilizira v citoplazmi ter sodeluje v interakcijah, pomembnih za ponoven vstop v jedro.

CBC v citoplazmi nadomesti translacijski iniciacijski faktor elF4F, ki se veže na kapo ter pripomore k vezani ribosomov za začetek translacije. Pri Tcl1 RNA sta 3'- konec in 5'-konec prostorsko blizu drug drugega. Vezava Sm7 na 3'-konec zato lahko povzroči disociacijo CBC iz 5'-konca ali/in lažjo vezavo elF4F na isto mesto.

Ponovno vračanje v jedro

Kap122 pomaga pri ponovnem importu Tlc1 RNA v jedro. Nato med zorenjem obroč Sm7 stabilizira 3'-konec RNA in omogoča hipermetilacijo na 5'-koncu preko encima Tgs1. Nato Tgs1 omogoči nastanek TMG kape na 5'-koncu in s tem se zorenje zaključi. V rastlinskih in živalskih celicah so za ta proces ključna Cajalova telesa, ki pa jih pri kvasovkah ne opazimo. Tgs1 pri kvasovkah ostaja na podobni lokaciji, zato predvidevamo, da do trimetilacije snRNA in snoRNA prihaja v jedru.

Sm7 je nujen za zorenje 3'-konca RNA, saj se Tlc1 brez njega razgradi v citoplazmi. Nasprotno pa Tgs1 in TMG-kapa nista nujna, saj njuna odsotnost povzroči le majhne spremembe.

Pomanjkanje metilacije telomerazne RNA s homolognimi encimi kot je Tsg1 vodi do različnih posledic. V človeških celicah izguba Tgs1 povzroči večjo koncentracijo RNA telomeraze in posledično podaljšanje telomer, pri brstečih kvasovkah pa se ravni RNA telomeraze zmanjšajo ter aktivna telomeraza vsebuje samo Tlc1 RNA na katero je že vezana TMG-kapa, kar odpira več možnosti za nastanek kape. Če se telomerazni RNP sestavi šele po dodatku TMG-kape v jedru, bi to pomenilo dodatno kontrolo kakovosti RNA, če pa se sestavi pred dodatkom TMG-kape v citoplazmi, pomeni, da je hipermetilacija obvezen korak pred vstopom v nukleoplazmo in je ključna za nadaljnje delovanje.

Dodatni cikli transporta

Dokazano je, da se RNA Tlc1 premika iz jedra v citoplazmo in nazaj. Temu procesu rečemo shuttling. Verjetno se premika večkrat, kar pomeni, da se cikel ponavlja, saj se zrele Tlc1, ne zadržujejo v jedru, kot bi to pričakovali. Večkratno premikanje bi služilo kot kontrolna točka za pravilno zvitje in funkcionalnost RNA, kar je pomembno za stabilnost in večkratno uporabo kot matrico za sintezo telomer.

Pri uvedbi temperaturno odvisne mutacije v Mex67, razmerje med jedrnimi in citoplazemskimi Tlc1 ostaja enako, s čimer dokažemo neprekinjeno premikanje Tlc1 in sklepamo, da Mex67 ni nujen za ponovni izvoz zrele Tlc1. Tlc1 RNA takoj po transkripciji ima m7G kapo na 5'-koncu, njena stabilnost pa je odvisna od Mex67. Po prvem ciklu prehoda pa ima vezan Sm7 obroč ter vsebuje TMG-kapo. RNP, ki nastane takoj po transkripciji ima vezan CBC, ki se odstrani pred ponovnim vstopom v jedro, zato zrela Tlc1 nima CBC in bi potrebovala alternativne RNA-vezavne proteine za izvoz ter drugačen adaptor kot Mex67.

Interakcije z različnimi proteini

Med ključnimi proteini, ki se vežejo na Tlc1(kvasna telomerazna RNA), so Pop1, Pop6 in Pop7, ki prispevajo k stabilnosti in pravilni tridimenzionalni strukturi RNA, ter proteini Est1, Est2 in Est3, ki sodelujejo pri sestavi aktivne telomeraze.Minimalno katalitično jedro telomeraze tvori kompleks Tlc1–Est2, pri čemer Est2 deluje kot katalitična podenota, odgovorna za podaljševanje telomer.Kompleks Tlc1- Est2 se z Est1 in Est3 proteinoma povezuje le v določenem delu celičnega cikla. To lahko deluje kot regulacijski mehanizem, ki omejuje čas delovanja telomeraze na telomerah.Est3 deluje kot povezovalni člen med Est1 in Est2. Ta se ne veže direktno na RNA in je nujno potreben za delovanje telomeraze v celici kvasovke(in vivo).Obstajajo dokazi o disociaciji Est2 in razgradnji telomeraze po podaljševanju telomer v pozni fazi S/G2. Zdi se tudi, da količina Est1 ni konstantna, temveč niha med celičnim ciklom kar lahko omejuje njegovo povezovanje s Tlc1 na specifično časovno okno v pozni fazi G1/S.

Telomeraza ni vedno aktivna njeno delovanje je strogo časovno regulirano (glede na celični cikel).Če manjkajo Est proteini, Tlc1 RNA kopiči v citoplazmi, kar nakazuje, da se podenote Est s Tlc1 RNA povezujejo že v citoplazmi.Raziskovalci so prav tako zasledili, da se Tlc1 skupaj s Pop in Est proteini sestavlja že v citoplazmi, preden vstopi v jedro. Ta korak verjetno deluje kot kontrolni mehanizem, ki omogoča v jedro vstopiti le pravilno zviti in funkcionalni telomerazi.Če je ta proces moten (npr. pri mutacijah), se Tlc1 kopiči v citoplazmi, kar kaže na napake v zvijanju ali sestavljanju kompleksa.Če pride do napak (npr. mutacije v Pop ali Est proteinih), se Tlc1 pogosto kopiči v citoplazmi, kar pomeni, da ne more pravilno vstopiti v jedro in opravljati svoje funkcije. Kar pomeni, da lahko celica prepreči vstop nepravilno sestavljene ali nefunkcionalne telomeraze v jedro.

yKu (yKu70/80) je protein, ki se lahko veže bodisi na telomerno DNA bodisi na Tlc1 RNA, vendar ne na oboje hkrati.Deluje kot molekularno stikalo, ki pomaga usmerjati telomerazo in preprečuje njeno napačno delovanje.Sir4 je telomerni regulatorni protein, ki se veže na yKu in sodeluje pri lokalizaciji telomeraze v bližini telomer. yKu in Sir4 prav tako preprečujeta, da bi telomeraza delovala na poškodovani DNA.

Dinamika vezave

Ostaja vprašanje, kdaj natančno se RNA Tlc1 poveže z različnimi proteini?

Nekateri posredni dokazi kažejo, da se asociacije Est, Pop in yKu proteinov zgodijo v citoplazmi, še preden pride do ponovnega vnosa v jedro in rekrutacije na telomere. Teoretično bi bil popolnoma sestavljen telomerazni RNP( ena Tlc1 RNA molekula plus Sm7, Est1/Est2/Est3, Pop1, Pop6/Pop7 in yKu heterodimer) še dovolj majhen, da bi se lahko prenesel skozi jedrne pore v jedro.Vendar pa je bilo kasneje pokazano, da večji kot so proteinski kompleksi, več enot jedrnih lokalizacijskih signalov (NLS) je potrebnih za njihov vnos v jedro.Zato predvidena precej velika velikost kvasne telomeraze (~1300 kDa) verjetno zahteva enega ali več NLS signalov, da lahko preide skozi jedrno poro,ti so lahko prisotni na Est, yKu in/ali Pop proteinih.Zato ostaja odprto vprašanje, ali telomerazni RNP dejansko prehaja v jedro kot popolnoma sestavljen kompleks, ali pa se sestavljanje nadaljuje tudi po vstopu v jedro. Možno je, da gre za postopno sestavljanje (stepwise assembly), kjer se posamezni proteini pridružujejo v različnih celičnih predelih.Tak mehanizem bi lahko predstavljal tudi kontrolno točko, ki zagotavlja, da v jedro vstopi le pravilno sestavljen in funkcionalen kompleks telomeraze. S tem bi celica preprečila neustrezno aktivnost telomeraze in njeno delovanje na napačnih mestih v genomu, kot so dvoverižni prelomi DNA.

Zaključek

Po transkripciji se Tlc1 hitro poveže z različnimi proteini. Za transport v citoplazmo so ključni eksportni faktorji, ki RNA stabilizirajo in ščitijo pred razgradnjo. Natančen čas in način teh zgodnjih interakcij še vedno nista popolnoma razjasnjena. Pomembna ideja je, da Tlc1 ne obstaja v eni stabilni obliki, ampak se njena sestava spreminja skozi čas — od “mlade” novo nastale RNA do “zrelega” telomeraznega kompleksa. Ta sprememba sestave vpliva na stabilnost, lokalizacijo in funkcijo telomeraze. Zato je ključno odprto vprašanje, kdaj in kako se posamezne podenote telomeraze najprej vežejo na Tlc1 ter ali poteka več ciklov transporta med jedrom in citoplazmo.Na splošno to kaže, da je telomeraza dinamičen in večstopenjski sistem, katerega natančen življenjski cikel še ni v celoti razjasnjen. Na Tlc1 se tudi vežejo različni proteini kot so Pop1, Pop6 in Pop7, ki prispevajo k stabilnosti in pravilni tridimenzionalni strukturi RNA, ter proteini Est1, Est2 in Est3, ki sodelujejo pri sestavi aktivne telomeraze.Vendar tudi tukaj še marsikaj ni jasno med drugim ostajajo vprašanja ali se proteini (npr. Est1, Est2, Ku, Pop1/6/7) vežejo na TLC1 v jedru, citoplazmi ali oboje in ali obstaja točno določen vrstni red vezave.

Viri

1. Bartle, L., Vasianovich, Y. & Wellinger, R.J. Maturation and shuttling of the yeast telomerase RNP: assembling something new using recycled parts. Curr Genet 68, 3–14 (2022). https://doi.org/10.1007/s00294-021-01210-2

2. Yulia Vasianovich, Emmanuel Bajon, Raymund J Wellinger: Telomerase biogenesis requires a novel Mex67 function and a cytoplasmic association with the Sm7 complex eLife 9:e60000 (2017). https://doi.org/10.7554/eLife.60000

3. Evan P. Hass, David C. Zappulla: Repositioning the Sm-binding site in S. cerevisiae telomerase RNA reveals RNP organizational flexibility and Sm-directed 3′-end formation bioRxiv (2017). 167361 doi: https://doi.org/10.1101/167361

4. Zappulla, D. C.: Yeast Telomerase RNA Flexibly Scaffolds Protein Subunits: Results and Repercussions. Molecules. 2020, 25, 2750. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules25122750

5. Neumann, H., Bartle, L., Bonnell, E., Wellinger, R. J.: Ratcheted transport and sequential assembly of the yeast telomerase RNP. Cell Reports. 2023, 42, 113565. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113565

6. John E. Gallagher, J. David Fiedler, et al.:A comprehensive multi-layered map of molecular interactions in the human cell. Cell (2016). DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.040