Kondenzini

Uvod

Kondenzini so bili identificirani v vseh evkariontskih genomskih sekvencah, prav tako so bili kondenzinom podobni kompleksi odkriti pri skoraj vseh prokariontskih vrstah, kar kaže na to da so bili izvorno prisotni še pred pojavom nukleosomov, kot glavnih organizacijskih enot kromosomov. Kondenzini imajo pomembno vlogo pri uspešnem kompaktiranju kromosomov, saj v celicah z zmanjšanim izražanjem kondenzinov pride do zamudne in slabše kondenzacije kromosomov. Zato je strukturna celovitost kromosomov znatno ogrožena v odsotnosti funkcionalnih kondenzinov.

Struktura

Evkariontski kondenzini so sestavljeni iz dveh glavnih podenot Smc2 in Smc4, ki sta strukturno 50nm dolgi antiparalelno zaviti vijačnici in spadata v družino proteinov, ki ohranjajo strukturo kromosomov SMC(structural maintenance of chromosmes protein). Posamezna Smc podenota je sestavljena iz dveh vijačnic, ki izhajata iz skupnega zgloba, se ovijata druga okoli druge in se na koncu združita v globularno domeno, ki ima ATPazno aktivnost. Takšni dve SMC podenoti sta povezani med seboj preko zgloba (hinge domain) in tvorita značilno V obliko molekule z ATPazno domeno na vsakem od koncev zavitih vijačnic. Predvideva se, da se dve ATPazni domeni združita, ko med sebe ujameta dve ATP molekuli, njuna razdružitev pa naj bi bila posledica hidrolize ATP. Amino konec ene globularne domene SMC se poveže z nasprotnim karboksilnim koncem druge tako, da skupaj tvorita obojestranski žep za vezavo ATP molekule. Čeprav je namen in mehanizem še vedno slabo raziskan, je ATPazni cikel za normalno delovanje kondenzinov nujno potreben. To potrjujejo poskusi z mutacijami na mestih za vezavo ATP, zaradi katerih postanejo kondenzini nefunkcionalni. Med opazovanjem kristalnih struktur ATPazne domene ni bilo opaženih večjih konformacijskih sprememb. Do odločilne spremembe naj bi prišlo šele takrat, ko se na domeni vežejo še nekateri dodatni proteini celotnega kondenzinskega kompleksa. Takrat namreč pride do znatne rotacije v zavitih vijačnicah pritrjenih na globularni domeni. V običajnih okoliščinah je SMC vezavni partner protein iz naddružine proteinov imenovane kleisin (kleisimo, grško za 'bližje'). Ta protein poveže obe končni ATPazni, globularni domeni med seboj. β ali γ podenoti evkariontskega kleisina se s svojo alfa vijačno domeno na amino koncu poveže z Smc2 globularno domeno in C končno krilato helično strukturo z Smc4 globularno domeno. Nedavne kristalne strukture karboksilnega oziroma amino konca domen prokariontskega kleisin kompleksa z SMC, kažejo da amino končne alfa helične stukture tvorijo trojni heliks z SMC zavito vijačnico v bližini njene globularne ATPazne domene in ne direktno s samo domeno. Na drugem C končnem delu, pa krilata helična struktura interagira z dvema β ploskvama Smc4 globularne domene. Na tak način lahko kompleks skupaj s klesinom tvori zaprt obroč tudi takrat, ko domeni zaradi nevezanega ATP nista združeni. Kleisin vezan na Smc domeni privabi še dva druga proteina, ki vsebujeta številne HEAT(hantingtonov elongacijski faktor3, protein fosfataza 2A in kinaza TOR1) ponovitve.

Interakcija kohezinov in kondenzinov z DNA

Kohezin vezavna mesta mesta pri človeku sovpadajo s CTCF (CCCTC-binding factor – protein, ki ima v transkripciji široko vlogo). CTCF verjetno blokira insulatorni protein, ki z ustvarjanjem DNA zank preprečuje povezavo promotorja in oddaljenih ojačevalnih zaporedij. Tako kohezini posredno omogočajo povezavo različnih delov molekule DNA. CTCF verjetno sodeluje pri lociranju kondenzina, ko je ta že naložen na DNA. V času mitoze so kohezini odstranjeni z molekule DNA, da se lahko kromatidi ločita, po ločitvi pa se na DNA zopet naložijo. Nalaganje na DNA zahteva Scc2-Scc4 kompleks, vloga katerega še ni pojasnjena. Lahko pa neposredno vpliva na vezavo kohezina na DNA. Ko je kohezin enkrat naložen, se s pomočjo RNA polimeraz premika po DNA, dokler se ne ustavi zarad bližnje prepisujoče enote. Kohezini se vežejo predvsem med bližnje prepisujoče enote. Geni, ki sodelujejo v nekem procesu, se pogosto nahajajo v skupnem delu jedra, pa čeprav so na genomu locirane čisto ločeno (primer – jedrce). To omogočajo kondenzini (pokazano na primeru tDNA genov pri kvasovkah). Nalaganje kondenzinov na tDNA gene je povezano z RNA polimerazo III, a se lahko kondenzini naložijo tudi brez RNAPIII, in sicer preko transkripcijskih faktorjev TFIIIB in TFIIIC. Tudi kondenzini naj bi se nalagali preko Scc2-Scc4 kompleksa, a ne v bližini prepisujočih regij. Zelo verjetno morajo pri tem sodelovati tudi drugi proteini, ki so različni pri različnih organizmih. Kondenzin je na DNA naložen tako, da Smc2-Smc4 kompleks skupaj s kleisinom obkroža eno verigo DNA.

Kondenzini I in kondenzini II

Večina evkariontskih celic ima 2 tipa kondenzinov: kondenzin I in kondenzin II. Razlikujejo se po kleisinskem in HEAT delu. Kondenzin I ima gama klesin podenoto CAR-H in HEAT ponovitvene enote, CAP-D2 in CAP-G. Kondenzin II ima beta klesin podenoto in CAP-H2 in HEAT ponovitvene enote, CAP-D3 in CAP-G2. Kondenzini I so ohranjeni od kvasovk do človeka, medtem ko kondenzinov II kvasovke nimajo. Ti se v jedru že med interfazo, in sodelujejo pri začetnem kompaktiranju DNA v prometafazi. Kondenzini I pa so med interfazo v citoplazmi, in dobijo dostop do DNA po razgradnji jedrne ovojnice na koncu prometafaze, ter tako sodelujejo v nadaljnem procesu mitoze.

Vloga kohezinov in kondenzinov

Tako kondenzini, kot tudi kohezini sodelujejo pri organizaciji interrfaznega genoma in kontroli izražanja genov. Poleg tega preprečujejo interakcijo med oddaljenimi regijami kromosoma. Z novimi raziskavami se odkriva še dodatne vloge oz. funkcije kondenzinov in kohezinov, ki so v celici očitno precej pomembni. Tako je človeško vedenje o teh proteinskih kompleksih in o tem, kako se s spremembo organizacije kromosomov spreminjajo celične funkcije, vse širše. Kohezini povežejo sestrski kromatidi za čas od S faze do mitoze. Potem se odstranijo, da se kromatidi lahko ločita. Kondenzini imajo svojo vlogo predvsem v času mitoze. Skrbijo za začasno kompaktiranje kromosoma, da ne pride do neželenih interakcij med različnimi deli DNA. Kondenzini imajo pomembno vlogo tudi pri ločevanju kromatid. Če je kateri od kondenzinov okvarjen, se to kaže v DNA mostičkih med kromosomi v anafazni ločitvi kromatid. Kondenzini in kohezini imajo v celici še druge vloge, ki so v teh letih predmet mnogih raziskav.

Regulacija

Različne kinaze med celičnim ciklom s fosforilacijo regulirajo delovanje kondenzinov. Našli so veliko število fosfoserinskih in fosfotreoninskih ostankov na SMC4 in treh drugih podenotah. Na ostankih na SMC2 je bilo odkritih le nekaj primerov fosforilacije. Zanimiv je podatek, da je večina fosforilacijskih mest na ostalih podenotah zbranih v relativno kratkih in slabo koncentriranih regijah, ki so predvidoma del prožne peptidne zanke. Nagnjenost k nestrukturiranim regijam je mogoče posledica povečane dostopnosti tarčnih mest za ustrezne kinaze. Ugotovili so, da so kondenzini v človeških celicah stalno fosforilirani. Se pa pri tem razlikujejo fosforilacijski vzorci med interfazo in mitozo, kar je v skladu s spremembami pri elektroforetični mobilnosti, izmerjeni za izolirane podenote kondenzinov iz posamezne faze. Presenetljivo je, da se večina M-faznih specifičnih fosforilacijskih mest ne striktno ujema z zaporedjem, ki je znano za mitotsko kinazo. Ena izmed možnosti je, da je posamezen ostanek modificiran z različnimi kinazami in/ali fosfatazami. Tako so fosforilacijski vzorci kondenzina rezultat kombiniranega delovanja različnih encimov. Odkrili so najmanj 6 različnih encimov, ki delujejo na takšen način: CDK, PLK, Aurora B kinaza, kazein kinaza 2 (CK2) in proteinski fosfatazi 2A (PP2A) in Cdc14. Njihov učinek na delovanje kondenzina se od organizma do organizma razlikuje.

Od ciklina odvisna kinaza (CDK): Za kompleks ciklin B-CDK1 je bilo ugotovljeno, da in vitro in in vivo fosforilira kondenzine pri kvasovki Saccharomyces cerevisiae in tudi pri večceličnih organizmih. Pri kvasovki Cdc2 fosforilira podenoto Cut3 (SMC4). S tem se sproži kopičenje kondenzina v jedru pred pričetkom mitoze. Pri večceličnih organizmih kondenzin I postane izpostavljen visoki ravni CDK. NEBD s podenoto CAP-D2 je pri tem glavna tarča fosforilacije. Prav tako obstaja dokaz, da CDK regulira tudi aktivnost kondenzina II: s CDK povzročena fosforilacija podenote CAP-D3 na kondenzinu II spodbuja zgodnjo fazo kondenzacije kromosoma med profazo. Tako je fosforilacija CAP-D3 izhodišče za hiperfosforilacijo kondenzina II z drugimi kinazami. Med fazo G2 in profazo naj bi fosforilacijo povzročal kompleks A-CDK1, kondenzin II pa naj bi povzočal krajšanje kromosomskega kraka. Ciklin B-CDK1 naj bi vzdrževal fosforilacijo med pozno fazo mitoze, ko kondenzin I že pridobi dostop do kromosoma. Regulacija preko A in B ciklina mora postati še eksperimentalno potrjena.

Aurora B kinaza: Funkcija Aurore B kinaze je poleg reguliranja vretena in pritrjanja kinetohorov tudi kontroliranje funkcije kondenzina. Pri Saccharomyces cerevisiae Aurora kinaza IpI1 fosforilira podenoto kondenzina Ycg1 (CAP-G) med mitozo, vzdržuje pa tudi kompaktnost rDNA regij med anafazo. Mutacija IpI1 ne učinkuje na kondenzin, ki se naloži na kromosom. Aurora B kinaza je prav tako potrebna za kopičenje kondenzina I na kromosom od prometafaze pa vse do anafaze pri D. melanogaster, človeških celicah in ekstraktu iz žabjega jajčeca. Pri raziskavah na C. Elegans in HeLa celicah pa ob odsotnosti Aurore B kinaze ni prišlo do opazne spremembe pri kondenzinih v povezavi s kromosomi. Ena izmed možnih razlag je ta, da so različne kromosomske regije drugače občutljive na spremembo v aktivnosti Aurore B. Polo podobne kinaze (Polo-like kinase; PLK): Regulacija kondenzina s pomočjo PLK ja najbolj znana pri S. Cerevisiae. Med zgodnjo anafazo Cdc5 (PLK) fosforilira veliko število ostankov na treh ne-SMC podenotah na kondenzinu. Aktivnost PLK je potrebna za pravilno kondenzacijo ponovitev rDNA in povečan učinek kondenzina na dodatno zvitje DNA ob prisotnosti topoizomeraze I. Topoizomeraza zahteva predhodno s CDK povzročeno fosforilacijo kondenzina. To nakazuje, da lahko CDK in PLK delujeta usklajeno in tako vzdržujeta aktivacijo kondenzina. Podobna vloga obeh kinaz je bila predlagana tudi za regulacijo kondenzina II. Pri človeških celicah mora biti najprej fosforilirana CAP-D3 podenota, to fosforilacijo povzroči CDK. Ko pride do tega, lahko PLK1 fosforilira ostale podenote kondenzina.

Kazein kinaza 2 (CK2): CK2 fosforilira kondenzin I v HeLa celicah. Fosforilacija je najvišja med interfazo in zelo zmanjšana med mitozo, povzroča pa zmanjšano tvorbo dodatnega zvitja. Tako bi imela lahko kinaza pomembno vlogo kot supresor aktivnosti kondenzina v interfazi.

Fosfataza: Znani sta dve fosfatazi, ki med mitozo regulirata vezavo kondenzina na kromosom.

Razumevanje celotnega poteka fosforilacije pri kondenzinih je še vedno slabo poznano. Pri vretenčarjih je kondenzin I neaktiven med interfazo, kar vzdržuje CK2. Kondenzin II naj bi bil aktiviran pred kondenzinom I s fosforilacijo, ki jo povzroči A-Cdk kompleks, kasneje pa fosforilacijo vzdržuje B-Cdk skupaj z dodatno fosforilacijo PLK. Deaktivacijo obeh kondenzinov ob koncu anafaze povzroči fosfataza PP2A za kondenzin II oz. fosfataza Cdc14 za kondenzin I. V primeru, da ima organizem samo en tip kondenzina, naj bi bil aktivacijski mehanizem podoben (negativna regulacija med interfazo še ni poznana).

Zaključek

Nadaljne raziskave na področju kohezinov in kondenzinov bodo obogatile znanje o posameznih delih teh proteinskih kompleksov, o regulaciji posameznih delov, ter o vplivu na funkcijo. Tako bomo dobili boljši in širši pregled nad širokim spektrom funkcij kohezinov in kondenzinov v celici.

Viri

1. Piazza, I., Haering, C. H. & Rutkowska, A. Condensin: crafting the chromosome landscape. Chromosoma 122, 175–90 (2013).

2. Thadani, R., Uhlmann, F. & Heeger, S. Condensin, chromatin crossbarring and chromosome condensation. Curr. Biol. 22, R1012–21 (2012).

3. Hirano, T. Condensins: universal organizers of chromosomes with diverse functions. Genes Dev. 26, 1659–78 (2012).

4. Wood, A. J., Severson, A. F. & Meyer, B. J. Condensin and cohesin complexity: the expanding repertoire of functions. Nat. Rev. Genet. 11, 391–404 (2010).

5. Bazile, F., St-Pierre, J. & D’Amours, D. Three-step model for condensin activation during mitotic chromosome condensation. Cell Cycle 9, 3243–55 (2010).