Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah

1. Uvod

Uporaba obnovljivih virov energije postaja v današnjem času vedno bolj zaželjena. S pomočjo fotosintetskih organizmov bi lahko v prihodnosti dosegli pridobivanje določenih kemijskih spojin izključno z izkoriščanjem sončne svetlobe. Za uporabo v sintezni biologiji so med fototrofi najprimernejše cianobakterije in alge. V primerjavi z višjimi evkarionti lahko predvsem s cianobakterijami lažje genetsko manipuliramo, rast celic je hitrejša in gojenje ne zavzema obdelovalnih površin. Kljub temu razvoj sintezne biologije na tem področju precej zaostaja, saj je večina raziskav usmerjena v delo z bakterijo Escherichia coli ali kvasovko Saccharomyces cerevisiae.¹

2. Orodja za delo s cianobakterijami in algami

a) Osnovni biološki deli

Trenutno obstaja le malo bioloških delov, namenjenih specifično cianobakterijam ali algam. Uporaba endogenih bioloških delov je zaradi kompatibilnosti s celičnimi mehanizmi transkripcije in translacije privlačna izbira, vendar lahko na njihovo delovanje vplivajo tudi neželeni regulatorni procesi.¹ Primer takšnega delovanja so promotorji. Med endogenimi promotorji se pri cianobakterijah najpogosteje uporabljata močna promotorja P_psbA in P_epcB. Ker kontrolirata transkripcijo genov za proteine fotosinteze, sta zelo občutljiva na svetlobne dražljaje, ki lahko vplivajo na njuno delovanje in s tem na končne rezultate.² Po drugi stani je lahko tudi uporaba eksogenih bioloških delov nepredvidljiva. Biokocke, ki se uporabljajo v E. coli, se v cianobakterijskih celicah pogosto obnašajo drugače kot v celicah E. coli. Aktivnost določenih močnih promotorjev (P_lac, P_tet, λ P_R) je v celicah Synechocystis sp. PCC 6803 izredno nizka ali celo ničelna. Obenem je moč P_trc1O iz E. coli v istem sevu 4-krat večja od moči endogenega promotorja P_rbcL.³ Na omenjene razlike med drugim gotovo vpliva sestava holoencima cianobakterijske RNA-polimeraze, ki ima v primerjavi z drugimi bakterijami drugačno strukturo β' podenote.² Pri delu z algami so najučinkovitejši endogeni promotorji genov z visoko stopnjo izražanja, uporabili pa so tudi evkariontske virusne promotorje. O delovanju različnih terminatorjev je za enkrat še malo raziskanega. Uporablja se le nekaj endogenih zaporedij in nekateri terminatorji iz E. coli.¹ Učinkovitost vezavnih mest za ribosome variira glede na vrsto organizma, sosednja zaporedja ter razdaljo med Shine-Dalgarnovim (SD) zaporedjem in start kodonom. Glede na raziskavo iz leta 2011, naj bi bila učinkovitost translacije v Synechocystis sp. PCC 6803 pri vezavnem mestu za ribosom z zaporedjem UAGUGGAGGU približno 2-krat višja, kot pri zaporedju AUUAAAGAGGAGAAA in 4-krat višja glede na zaporedji UCACACAGGAAAG in AAAGAGGAGAAA. V zaporedjih je podčrtan osrednji del SD zaporedja, ki pride v stik z 16S rRNA. Učinkovitost prvega izmed zaporedij lahko pripišemo podobnosti zaporedja z optimalnim SD zaporedjem (AAAGGAGGUGAU), ki je komplementarno zaporedju rRNA.² Zanimiva so tudi ojačevalna zaporedja, ki jih lahko pridobimo iz cianobakterij ali alg, saj mnoga delujejo v odvisnosti od svetlobe. 5' nekodirajoči regiji genov psbAII in psbAIII, ojačevalni zaporedji iz seva Synechococcus sp. PCC 7942, povzročita pod vplivom močne svetlobe v kombinaciji s promotorjem conII iz E. coli 4 do 11-kratno ojačitev transkripcije.⁴

b) Šasije

Sevi, ki jih uporabimo kot šasije v sintezni biologiji, bi morali biti v dobro poznani, predvidljivi, stabilni in kompatibilni z biokockami in plazmidi, ki jih vanje vnašamo. Pogosti cianobakterijski modelni organizmi so sevi Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in Synechococcus sp. PCC 7002. Med algami je najpogosteje uporabljena vrsta Chlamydomonas reinhardtii.^5,6

c) Metode transformacije in plazmidni vektorji

Metode vnosa DNA v cianobakterije so v veliki meri že uveljavljene. Najpogosteje gre za vnos z nativno transformacijo, elektroporacijo ali konjugacijo z E. coli. Na voljo so tako replikativni kot integrativni plazmidni vektorji. Replikativni plazmidi so lahko replikoni plazmidov s širokim spektrom gostiteljev ali pa so izvedeni iz endogenih plazmidov. Z biokockami je kompatibilen replikativni plazmid s širokim spektrom gostiteljev pPMQAK1 (BBa_J153000 v registru standardnih bioloških delov).^2,3 Vnos DNA v celice alg je zahtevnejši. Najpogosteje se uporabljajo bombardiranje s kovinskimi delci, mikroinjiciranje, elektroporacija, uporaba steklenih kroglic ali transformacija z bakterijo Agrobacterium tumefaciens.¹ Uspešna je bila tudi homologna rekombinacija po elektroporaciji v industrijsko pomembni algi Nannochloropsis sp.⁷

3. Uporaba modificiranih cianobakterij in alg

Gensko spremenjene cianobakterije in alge bi lahko predstavljale prihodnost pridobivanja biogoriv in drugih uporabnih kemijskih spojin iz obnovljivih virov. V primerjavi s trenutno uveljavljenimi postopki dvostopenjske pretvorbe biomase v gorivo s fermentacijo, bi omogočale neposredno pretvorbo ogljikovega dioksida v željeni produkt. Kot alternativna goriva bi lahko na ta način pridobivali biodizel, proste maščobne kisline, alkane, alkene, etanol, izobutanol, 1-butanol, vodik, itd.¹ Poskusi na cianobakterijah dajejo več rezultatov, vendar tudi ti za enkrat ostajajo na ravni laboratorijskih eksperimentov.⁸ Največji izkoristek pri pridobivanju biogoriv s fotosintetskimi organizmi so do zdaj dosegli pri proizvodnji etanola v gensko spremenjenih celicah Synechocystis sp. PCC 6803. S homologno rekombinacijo so vanje vnesli gene za piruvat-karboksilazo in obenem povišali izražanje endogene alkohol-dehidrogenaze. V 26-ih dneh so dosegli titer 5,50 g/L.⁹ Etanol pa ima veliko manjšo energijsko gostoto od drugih alkoholov s kratkimi ogljikovimi verigami, zato sta na primer izobutanol in butanol kot biogorivi primernejša.¹ V sevu Synechococcus elongatus PCC 7942 so z vnosom poti za biosintezo izobutanola po 8 dneh aktivnosti celic dosegli titer 0,45 g/L.¹⁰ Visoko energijsko gostoto imajo tudi maščobne kisline, njihovi alkoholni derivati in derivati alkanov. Sintezo in izločanje prostih maščobnih kislin so na primer povišali s povečanim izražanjem genov za tioesterazo, in sicer v sevih Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 in Synechococcus sp. PCC 7002.^1,8 Potencialno biogorivo bi lahko predstavljal tudi vodik, ki je v mnogih fototrofnih vrstah prisoten kot sekundarni metabolit. Njegovo proizvodnjo so poskušali povečati v algi C. reinhardti. Razvoj vodika so uspeli in vitro povečati za 5 do 13-krat z blokiranjem cikličnega prenosa elektronov v fotosistemu I. Tako so povečali število elektronov, ki bodo hidrogenazam na voljo za reakcijo biosinteze vodika v reakciji 2H⁺ + 2e^- -> H₂.¹¹ Proizvodnja biodizla z uporabo rastlin je v primerjavi s fosilnimi gorivi cenovno še vedno neugodna.⁸ Za večjo učinkovitost pridelave v cianobakterijah ali algah, bi lahko v celicah povečali vsebnost maščobnih kislin, iz katerih lahko biodizel proizvedemo. To je mogoče z blokiranjem določenih metabolnih poti ali povečanim izražanjem izbranih genov. Večji problem predstavlja postopek ekstrakcije lipidov, saj je energetsko potraten in vodi v nastanek stranskih produktov. Neželene učinke bi lahko odpravili s pripravo celic, ki bi biodje mogoče zmanjšati s predhodno lizo celic. V celice Synechocystis sp. PCC 6803 so na primer vnesli inducibilen sistem, ki v prisotnosti Ni²⁺ ionov sproži izražanje vnešenih bakteriofagnih genov za lizo in genov lipolitičnih encimov.^1,12 Cianobakterije in alge so gensko modificirali tudi v namen pridobivanja etilena, izoprena, acetona, poli-β-hidroksibutiratov, laktata, sladkorjev in drugih produktov, ki so poleg proizvodnje biogoriv na trgu prav tako zaželeni.¹

4. Omejitve in izzivi

Napredek v sintezni biologiji cianobakterij in alg bo v veliki meri odvisen priprave novih bioloških delov, primernih šasij in optimizacije metod za transformacijo celic. Čeprav so slednje za delo z mnogimi modelnimi cianobakterijskimi sevi že razvite, je transformacija filamentoznih sevov še vedno težavna. Omejujoč dejavnik so med drugim restrikcijske reakcije, ki potekajo v cianobakterijah in vivo, in bi jih lahko odpravili s pripravo sevov z napako v metilaciji DNA ali in vitro sistemi, ki bi lahko tujo DNA metilirali pred transformacijo.^1,13 Učinkovitost pretvorbe sončne energije cianobakterij in alg znaša 5-7 % med sezono rasti in le 3 % letno v bioreaktorjih, kar ne zadošča za efektivno uporabo organizmov v industriji. Prvi problem predstavlja zagotavljanje zadostne količine svetlobe za vse celice. Ker lahko svetoba prodre le do določene globine biorekatorja, velik del celic v notranjosti ni izpostavljen žarkom. Ena izmed možnih rešitev bi bila povečanje okna absorpcije svetlobe enega izmed obeh vrst fotosistemov. Tako bi povečali delež izkoriščene svetlobe, ki trenutno znaša le okoli 50 %.¹⁴ Drugi problem je nizka hitrost fiksacije CO₂, ki jo katalizira encim RuBisCO. Reakcijo še dodatno upočasni prisotnost kisika, ki se lahko nanj veže. Hitrost fiksacije bi lahko povečali s povišanjem količine CO₂-koncentracijskih mehanizmov, ki so jih razvile cianobakterije in nekatere alge. Le-ti omogočajo zbiranje encimov RuBisCO skupaj z ogljikovimi anhidrazami v karboksisomih. Anhidraze pretvarjajo HCO₃^- v CO₂, zaradi česar se razmerje CO₂/O₂ v okolici encimov RuBisCO poveča in pomakne ravnotežje reakcije v prid fiksaciji.^1,15 Povišana tudi raven reaktivnih kisikovih spojin, ki nastanejo zaradi višjih koncentracij kisika v fototrofih, je še posebej nevarna za encime, ki so na kisik občutljivi (npr. nitrogenaze). Negativno delovanje reaktivnih kisikovih spojin bi lahko znižali s časovno in/ali prostorsko segregacijo procesov fotosinteze. Smiselna bi bila tudi priprava encimov, ki lahko tolerirajo višje koncentacije kisika, z mutagenezo.^1,16 K poznavanju genomov, regulatornih omrežij, metabolnih poti in identifikaciji novih genov bodo v prihodnosti gotovo velik del doprinesle raziskave in silico. Različne veje sistemske biologije (transkriptomika, proteomika, metabolomika) bodo najverjetneje prispevale k povečanju števila in raznolikosti orodij za delo s cianobakterijami in algami. Obenem bi lahko metabolnim modeliranjem natančneje določili mesta za optimizacijo metabolnih poti in s tem dosegli višje izkoristke pri proizvajanju želenih produktov.¹

5. Zaključek

Cianobakterije in alge kažejo velik potencial za proizvodnjo različnih kemijskih spojin s pretvorbo svetlobne energije in ogljikovega dioksida. Mnoge raziskave že dajejo pozitivne rezultate in doprinašajo k našem razumevanju teh organizmov. Vseeno bo za prehod z laboratorijskih poskusov na nivo industrijske proizvodnje na področju sintezne biologije v cianobakterijah in algah potrebno še veliko dela.

6. Literatura

1. Wang, B., Wang, J., Zhang, W. & Meldrum, D. R. Application of synthetic biology in cyanobacteria and algae. Front. Microbiol. 3, 43–57 (2012).

2. Heidorn, T. et al. Synthetic Biology in cyanobacteria: engineering and analyzing novel functions. Methods Enzymol. 497, 539–579 (2011).

3. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P. & Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res. 38, 2577–2593 (2010).

4. Li, R. & Golden, S. S. Enhancer activity of light-responsive regulatory elements in the untranslated leader regions of cyanobacterial psbA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11678–11682 (1993).

5. Berla, B. M. et al. Synthetic biology of cyanobacteria: unique challenges and opportunities. Front. Microbiol. 4, 1–14 (2013).

6. Gimpel, J. A., Specht, E. A., Georgianna, R. D. & Mayfield, S. P. Advances in microalgae engineering and synthetic biology applications for biofuel production. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 489–495 (2013).

7. Kilian, O., Benemann, C. S. E., Niyogi, K. K. & Vick, B. High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 21265–21269 (2011).

8. Savakis, P. & Hellingwerf, K. J. Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 8–14 (2015).

9. Gao, Z., Zhao, H., Li, Z., Tan, X. & Lu, X. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ. Sci. 5, 9857–9865 (2012).

10. Atsumi, S., Higashide, W. & Liao, J. C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180 (2009).

11. Kruse, O. et al. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 280, 34170–34177 (2005).

12. Liu, X. & Curtiss, R. Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21550–21554 (2009).

13. Koksharova, O. & Wolk, C. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 123–137 (2002).

14. Blankenship, R. E. et al. Comparing photosynthetic and photovoltaic efficiencies and recognizing the potential for improvement. Science (80-. ). 332, 805–809 (2011).

15. Espie, G. S. & Kimber, M. S. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth. Res. 109, 7–20 (2011).

16. Fay, P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev. 56, 340–73 (1992).