Nehomologno povezovanje koncev

Dvojnovijačni zlomi DNA in njihovo popravljanje

Vsak dan se v človeškem genomu zgodi okoli 10 000 poškodb DNA, med katerimi so najbolj nevarni dvojnovijačni zlomi (DSB, "Double Strand Breaks"). Če se ti ne popravijo pravilno, lahko pride do celične senescence, apoptoze in različnih kromosomskih napak (vključno s translokacijami in delecijami). DSB-ji se popravljajo na dva načina - preko mehanizma nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ, "Nonhomologous End Joining") ali pa preko mehanizma homologne rekombinacije (HR, "Homologous Recombination). Pri mehanizmu nehomolognega povezovanja koncev gre za direktno ligacijo zlomljene molekule DNA, proces pa je neodvisen od zaporedja na zlomljenih koncih. Za razliko od drugega načina popravljanja dvojnovijačnih zlomov DNA (mehanizem homologne rekombinacije), ta mehanizem ne potrebuje homologne molekule DNA kot matrice za popravilo poškodovane DNA in zato ni odvisen od faze celičnega cikla. Mehanizem preko homologne rekombinacije je namreč možen samo, ko je na voljo sestrska kromatida - to pa je med S in G2 fazo celičnega cikla.

Protein Ku in njegova vloga pri NHEJ

Popravljanje preko nehomolognega povezovanja koncev se začne z vezavo proteina Ku na mesto zloma. Ku je heterodimerni protein, sestavljen iz podenot Ku70 in Ku80 in se nahaja v jedru. Ima sposobnost zelo hitre lokalizacije in vezave na DSB. Razlogi za to so njegova zelo velika afiniteta za konce DNA, visoka koncentraciji v celici in nespecifičnost za zaporedja ob zlomih. Njegovi podenoti se razlikujeta v aminokislinski sestavi, vendar imata podobno sekundarno in nativno strukturo. Sestavljeni sta iz treh domen: N-končne (von Willebrandove) iz alfa-heliksa in beta-sodčka, centralne domene, ki je potrebna za dimerizacijo podenot in vezave na DNA, ter C-končne domene, ki jo sestavlja alfa-heliks. Dimer podenot tvori obroč, ki s centarlnima domenama obda molekulo DNA. Protein Ku se na mestu zloma naniza na DNA in se pritrdi na sladkorno ogrodje vijačnice (zato nespecifičnost za zaporedja pri zlomih) preko C-končne domene Ku70. Ku nato rekrutira ostale popravljalne faktorje. S C-končno domeno na podenoti Ku80 interagira z DNA-PK (od DNA odvisna kinaza) in ji omogoči vezavo na DNA. Na vijačnico se naloži s pomočjo N-končne levcinske zadrge. DNA-PK se sicer lahko tudi sama veže na DNA, vendar Ku poveča hitrost vezave približno stokrat. C-končna domena DNA-PK glede na N-končno tvori klešče, skozi katere gre molekula DNA. Interakcija DNA-PK z DNA povzroči premik proteina Ku naprej po dvojni vijačnici in tudi samo aktivacijo DNA-PK. Ku nato rekrutira tudi ligazni kompleks, ki je sestavljen iz DNA ligaze IV, XRCC4 in XLF. DNA ligaza IV in XLF interagirata s celotnim homodimerom Ku, medtem ko se XRCC4 specifično veže na podenoto Ku70. XRCC4 nima encimske aktivnosti in se poveže s XLF, pomen tega pa je stabilizacija zlomljenih koncev DNA. Pri procesu ima pomembno vlogo tudi protein APLF, ki zadržuje proteine XRCC4, XLF in DNA ligazo IV na mestu poškodbe.

Procesiranje koncev

Ligaza IV je zmožna spojiti le fragmente DNA, ki imajo ohranjen 3' hidroksilni in 5' fosfatni konec. Ker pa pri zlomu dvojne vijačnice pogosto prihaja do poškodb na koncih, je pred ligacijo navadno potrebno procesiranje kocev. Procesiranje koncev je proces, v katerem nukleaze odstranijo poškodovane ali napačne nukleotide na koncih zlomljene DNA molekule in polimeraze zapolnijo nastale presledke v DNA.

Encimi, ki sodelujejo pri procesiranju koncev v NHEJ poti, so Artemis, PNKP, APLF, Polimerazi μ in λ, Werner (WRN), aprataksin in Ku. Potrebne encime na nepovezljive konce usmeri Ku-XRCC4 kompleks.

Vrste kompleksnih koncev

Pri zlomu dvojne vijačnice lahko pride ohranjenega 3' fosfatnega ali 5' hidroksilnega konca. DNA na koncih lahko utrpi tudi poškodbe nukleotidov, najpogosteje so to oksidirane baze ter več abazičnih (AP) mest, t.j. mest na DNA, ki nimajo niti purinskih, niti pirimidinskih baz. Konci se lahko zvijejo v sekundarne strukture, kakršne so lasnične zanke, ali pa po poravnavi para koncev pride do neujemanj v nukleotidnem zaporedju, presledkov in »flap« struktur.

Popravljalni mehanizmi

3' fosfatne in 5' hidroksilne konce popravlja encim PNKP, ki ima hkrati kinazno in fosfatazno aktivnost. S svojo kinazno domeno doda fosfatno skupino na 5' OH in s fosfatazno domeno s 3' konca odstrani fosfat. Tako ustvari povezljiva konca, ki jih lahko združi DNA ligaza IV. Aprataksin je nukleotidna hidrolaza, ki odstranjuje adenilatne skupine, kovalentno vezane na 5' fosfatni konec. Ku protein ima liazno aktivnost in je sposoben izrezati AP mesta, blizu mesta zloma.

Najbolje poznan encim, ki sodeluje pri rezanju DNA koncev, je Artemis. Ima več različnih nukleolitskih aktivnosti, vključno s 5' proti 3' endonukleazno aktivnostjo, ki odreže 5' lepljivi konec in katere rezultat je dvoverižni topi konec. Artemis lahko odstrani tudi 3' fosfoglikolatne skupine z DNA koncev in odpre 5' proti 3' lasnične zanke. Artemis postane endonukleazno aktiven šele po tvorbi kompleksa in fosforilaciji z DNA-PKcs. Endo- in eksonukleazno aktivnost ima še mnogo encimov, ki sodelujejo pri NHEJ. WNR na primer deluje kot 3' proti 5' eksonukleaza in APLF kot 3' proti 5' endonukleaza.

Med samim zlomom in zaradi delovanja nukleaz med procesiranjem v DNA nastanejo presledki. Te zapolnjujeta polimerazi μ in λ. Polimeraza μ izvaja matrično-odvisno sintezo manjkajočih ali poškodovanih nukleotidov. Polimerizira torej na koncih, ki sta delno komplementarna. Polimeraza λ pa ima od matrike neodvisno aktivnost in liazno aktivnost, ki ji omogoča odstranjevanje poškodovanih baz

Klinični pomen nehomolognega povezovanja koncev

Popravljanje DSB z NHEJ pogosto vodi do kratkih insertov ali delecij na mestu zloma. Ta lastnost je vodila k poskusom uporabe NHEJ v zdravljenju osebkov, okuženih z virusom HIV. V T-celicah so delovali z nukleazo, zasnovano, da reže v CCR5 regiji gena, ki kodira za koreceptor za virus HIV. Popravilo zloma z NHEJ je ustvarilo celice z mutacijo v CCR5 regiji, ki so bile odporne na infekcijo z virusom. Pomembno je bilo tudi odkritje, da je NHEJ nadpovprečno aktiven v rakavih celicah, za katere je splošno značilna genomska nestabilnost. Genomska nestabilnost je vzrok za invazivnost in hiter razvoj tumorskih celic. Raziskava je pokazala, da inhibicija DNA ligaze IV resnično ovira širjenje tumorjev pri rakavih miših. Ti podatki kažejo na pomembnost NHEJ v celici in na možnost širše uporabe agentov, sodelujočih pri NHEJ, v medicinske namene.

Viri

1. Tropp, B. E. Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.
2. Davis, A. J. in Chen, D. J. DNA Double Strand Break Repair via Non-Homologous End-Joining. Translational Cancer Research. 2013, letnik 2, št. 3, str. 130-143.
3. Fell, V. L. in Schild-Poulter, C. The Ku Heterodimer: Function in DNA Repair and Beyond. Mutation Research. 2015, letnik 763. str. 15-29.
4.