Plasticure

http://2016.igem.org/Team:BGU_ISRAEL [[1]]

Uvod in ideja

Dandanes kopičenje plastike v naravi predstavlja resen problem za okolje, rastline, živali in ljudi. Naravna razgradnja je zelo počasen in neučinkovit proces. Skupina iz Izraela je poskušala rešiti ta problem z dvema komplementarnima metodama, s katerima bi dosegli popolno razgradnjo PET (polietilen tereftalata) do CO2, krati pa bi s pomočjo biogorivnih celic, narejenih iz biofilma gensko spremenjenih bakterij Pseudomonas putida (P. putida), tudi proizvajali električno energijo. V molekulah PET je namreč shranjeno veliko energije (v visokoenergetskih vezeh C–C). To bi v grobem dosegli na dva načina: 1. Z načrtno mutagenezo bi izboljšali katalitsko aktivnost encima LC-kutinaze, ki razgradi PET do monomerov tereftalata (TPA) in etilen glikola (EG). 2. Z genskim inženirstvom bi ustvarili sistem simbioze dveh bakterij, pri čemer bi E. coli po prvi stopnji razgradnje nadalje razgradila še etilen glikol, P. putida pa drugi monomer (tereftalat), ki bi bil hkrati tudi njen edini vir ogljika. P. putida bi bila odvisna od aktivnosti E. coli zaradi nutrientov, medtem ko E. coli ne bi mogla preživeti brez P. putide, saj je tereftalat toksičen.

Opis projekta

Proteinsko inženirstvo

Ekipa se je odločila izboljšati aktivnost encima LC-kutinaze. To je eden izmed najuspešnejših encimov za razgradnjo PET v monomera etilen glikol in tereftalno kislino. Na osnovi kristalne strukture so se odločili za njegovo izboljšavo z načrtno mutagenezo. Pri tem so uporabili algoritem PROSS (Protein Repair One Stop Shop), ki primerja zaporedje originalnega proteina z zaporedjem homolognih proteinov in izbere nabor mutacij. Algoritem nato izračuna razliko v prosti energiji (ΔΔG) vsake mutirane variante v primerjavi s prosto energijo divjega tipa proteina in izbere termodinamsko stabilne variante. Z uporabo tega algoritma so dobili 4 različne variante, katerih aktivnost, stabilnost in nivo izražanja so preverili nadalje (poleg teh štirih so pripravili tudi varianto z optimiziranim kodonom). Poleg tega so na N-konec proteina pripeli vodilno zaporedje pelB, ki je omogočilo, da je E. coli encim izločila v gojišče.

Gensko inženirstvo metabolnih poti

Naslednji korak, ki so ga želeli doseči, je bila popolna razgradnja monomerov do CO2, tako da kot produkt razgradnje ne bi ostala nobena toksična molekula. To bi dosegli z genetskim inženirstvom metabolnih poti zemeljske bakterije P. putida, v katero bi vstavili razgradno pot tereftalata. Drugi monomer, etilen glikol, bi razgradila E. coli, ki bi hkrati izločala izboljšano varianto LC-kutinaze. Tereftalatna razgradna pot, izpeljana iz bakterij Commamonas testosteroni, se konča s protokatehuatom, molekulo, ki je toksična za večino bakterij. Zanimivo pa jo lahko P. putida izrablja kot vir ogljika za rast. E. coli (sev BL21) pa bi razgradila PET z LC-kutinazo do monomerov, pri čemer bi bil etilen glikol njen vir ogljika. Na ta način bi dosegli popolno razgradnjo obeh produktov razgradnje PET. Za delo s P. putido so se odločili zaradi njenega raznolikega metabolizma, vključno z zmožnostjo razgradnje organskih topil in protokatehuata, njene podobnosti z E. coli (kar se tiče laboratorijskih protokolov), in njenih elektrokemijskih značilnosti, ki omogočajo uporabo te bakterije v gorivnih celicah. Njihov namen je bil gensko spremeniti P. putido, ki bi vsebovala dva plazmida. Vsak izmed njiju bi zapisoval za dve glavni komponenti: membranski transporter, ki bi prenesel tereftalat v celico, in potrebne gene za njegovo razgradnjo. Izbrali so si vektorja pSEVA224 in pSEVA434, ki sta bila že prej uporabljena v bakteriji P. putida KT2440. Prvi insert je vseboval 4 gene iz istega seva C. testosteroni za razgradnjo tereftalata v protokatehuat: tphA1, tphA2, tphA3 in tphB, drugi pa 3 gene iz C. testosteroni seva KF-1 za transport tereftalata iz periplazemskega prostora v citoplazmo: tphC, tctA in tctB. Da bi povečali izražanje, so na proksimalna mesta vsakega gena dodali vezavno mesto za ribosom G10L iz bakteriofaga T7. V E. coli so zapis za LC-kutinazo vnesli z vektorjem pACYC. Da bi dosegli simbiozo med obema bakterijama, so ju ločili z dializno membrano. E. coli, ki je izločala LC-kutinazo in izrabljala etilen glikol, se je nahajala znotraj membrane, ločena od P. putide, ki je izrabljala tereftalno kislino. Pore so prepuščale molekule velikosti do 14 kDa, kar je manj, kot znaša molekulska masa LC-kutinaze. Na ta način je bila mogoča difuzija razgradnih produktov iz membrane, tako da bili so na voljo tudi P. putidi, znotraj membrane pa je ostajala visoka koncentracija LC-kutinaze. V membrano so dodali PET. Njuna medsebojna odvisnost temelji na dejstvu, da je tereftalat edini vir ogljika za rast P. putide, a ne more nastajati v odsotnosti E. coli, ki izloča LC-kutinazo, medtem ko E. coli ne preživi v povišanih koncentracijah tereftalata, ki ga sicer razgradi P. putida.

Bioelektrokemijski sistem razgradnje PET

Proizvodnja PET iz fosilnih goriv je energetsko potraten proces, poleg tega pa so trenutne rešitve, kako se ga znebiti (reciklaža in zakopavanje), prav tako energetsko potratne. Zato se je raziskovalna skupina odločila poiskati alternativne možnosti, ki bi nam pomagale vzdrževati pozitivno energijsko ravnotežje. Bakterija P. putida, ki so jo izbrali za svoj poskus, naj bi bila eksoelektrogen, to je bakterija, ki je sposobna prenašati odvečne elektrone po elektrodah. PET je polimer, ki vsebuje ogromno energije, shranjene v vezeh C–C, ki bi jo po razgradnji tereftalata z bakterijo P. putida izrabljala mikrobna gorivna celica za proizvodnjo čiste električne energije. Poleg tega je pomembno tudi, da je bakterija po površini elektrode sposobna tvoriti biofilm, s čimer se izboljša delovanje mikrobne gorivne celice. P. putida KT2440 je ustrezala tudi temu kriteriju. Najprej so preizkusili možnost dodatka elektronskega mediatorja h gorivni celici, saj naj bi se na ta način izboljšalo njeno delovanje. Za ta namen so se odločili preizkusiti protokatehuat, saj je le-ta del tereftalatne metabolične poti, s čimer omogoči zmanjšano uporabo zunanjih reagentov in vzpostavitev samovzdrževalnega sistema.

Poskusi in ugotovitve

1. Ker je plastika precej nov sintetični polimer, ni veliko organizmov, ki bi se prilagodilo do te mere, da bi bili sposobni izrabljati plastiko kot edini vir ogljika. Tisti organizmi, ki pa so se prilagodili, pa plastiko izrabljajo na zelo neučinkovit način. Eden izmed njih je Rhodococcus ruber C208, za katerega so že pred leti dokazali, da je sposoben izrabljati polietilen. Skupino je zanimalo, ali isto velja tudi za PET, na katerega so se osredotočili v projektu (tega podatka v literaturi niso našli). Z merjenjem optične gostote pri 600 nm so to potrdili.
2. Degradacijsko aktivnost različnih variant LC-kutinaze so določili z različnimi koncentracijami substrata pNP-butirat (ima podobne vezi kot PET), do katerega ima LC-kutinaza visoko specifičnost. Po njegovi razgradnji se sprosti pNP, katerega količino se lahko enostavno in natančno določi z merjenjem absorbance pri 405 nm. Ugotovili so, da imajo vse variante večjo degradacijsko aktivnost v primerjavi z divjim tipom; največjo aktivnost so opazili pri varianti z optimiziranim kodonom, sledila ji je varianta F4.
3. Degradacijsko aktivnost variant z optimiziranim kodonom in F4 so preverili tudi z elektronskim mikroskopom. Koščke PET (in PE) so inkubirali v tekočem LB-mediju, v katerem so bile ustrezne bakterije, pri čemer so uporabili še dve kontroli: medij brez bakterij + PET in medij + PET + bakterije s plazmidom, a brez zapisa za LC-kutinazo. Očitna razlika v strukturi PET je dokazala degradacijsko aktivnost LC-kutinaze (manj gladka struktura po delovanju encima).
4. Za P. putido je bilo že znano, da lahko uporablja protokatehuat kot edini vir ogljika, a s poskusom so želeli določiti optimalne koncentracije. Želeli so preveriti tudi, ali lahko morda razgradi tereftalat po naravni poti, s čimer bi se potencialno lahko izognili modifikacijam metabolnih poti. Z merjenjem optične gostote so pokazali, da kot edini vir ogljika lahko uporablja PCA, ne pa tudi TPA.
5. Za mnoge seve E. coli je znano, da lahko uporabljajo EG kot edini vir ogljika, a podatka za BL21 ni bilo na voljo, zato so sami preverili, ali je to možno. Poleg tega so želeli določiti tudi optimalno koncentracijo EG za rast teh bakterij. Z merjenjem optične gostote so pokazali, da je to možno tudi pri sevu BL21.
6. Ko so preverili sposobnost različnih variant LC-kutinaze, da ragradijo pNP-butirat, so preverili nadalje, ali so bakterije E. coli seva BL21 pridobile sposobnost razgradnje PET in uporabe EG kot edinega vira ogljika. Bakterije so na agarnih ploščah s PET lahko zrasle le, če se je LC-kutinaza izrazila, izločila iz celice in če je lahko razgradila PET do EG in TPA. Na ploščah s PET so zrasle bakterije z vsemi variantami LC-kutinaze, kar najazuje na to, da encim razgradi PET, E. coli pa kot vir ogljika izrablja vsaj enega izmed obeh produktov (sklepajo, da je to EG).
7. S ciklično voltametrijo so preverili delovanje protokatehuata kot elektronskega madiatorja. Ko so potrdili njegovo delovanje (čeprav ne ravno idealno), so v 100-mililitrski čaši sestavili celico iz grafitne anode s P. putido, ki je tvorila biofilm, referenčne elektorde Ag/AgCl, števne elektrode in grafitne katode, ki so bile potopljene v medij s protokatehuatom. V območju 250–500 mV so opazili velik porast izhodne energije v primerjavi s kontrolo, kar nakazuje na možno uporabo te biogorivne celice na osnovi elektrokemijske aktivnosti P. Putide KT2440, vendar pa bi bilo potrebno izvesti še več dodatnih poskusov in določiti optimalne koncentracije protokatehuata.

Viri

http://2016.igem.org/Team:BGU_ISRAEL (dne 27.11.2016)

[SB 2016/17]