SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem. Spletna stran projekta: Avtorica povzetka: Maja Globočnik

OPIS PROBLEMA

Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

SESTAVLJANJE

Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ermC pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili. Celice E. coli, seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja. S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

Genetsko vezje

Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operator v bližini promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

REZULTATI

Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD. Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze

Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja. Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna. Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva. Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR. Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja. Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle pri različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

PRISPEVEK IN OBETI

Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt. V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico 'Fix the Flow'. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

VIRI

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.