Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

Uvod

Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

Oblikovanje plazmidov

Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9). TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek. Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša. Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice. Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.

Tumor specifični promotorji

Tako kot obstajajo specifični promotorji za različne zdrave celice in tkiva, so tudi za rakava tkiva značilni specifični promotorji, ki jih najdemo le v tumorskih celicah. Te promotorji so lahko vrstno specifični in jih najdemo le v omejenem tipu rakavih celic, ali pa so bolj splošni in jih najdemo v rakavih celicah različnih tkiv. To dejstvo lahko izkoristimo in plazmide skonstruiramo tako, da gene, ki jih želimo izraziti zgolj v tumorjih, damo pod kontrolo takšnih specifičnih promotorjev.

Promotor človeške telomerazne reverzne transkriptaze - hTERT

V zdravih telesnih celicah ta promotor ni metiliranin in omogoča vezavo represorja, kar preprečuje njegovo aktivnost. V tumorskih celicah pa pride do metilacije in posledičnega izražanja telomeraze, ki podaljšuje telomere in omogoča nesmrtnost rakavih celic. hTERT so v raziskavah že uporabili kot promotor, ki nadzoruje ne-metastazni klon 23, izoform H1 gen - gen , ki preprečuje metastaziranje in s tem preprečili širjenje tumorja v okoliška tkiva. Uporabili so ga tudi kot promotor gena za citotoksičen peptid. Ta se je posledično izrazil samo v rakavih celicah in zaustavil njihovo nenadzorovano proliferacijo.

Promotor gena BIRC5

Ta gen je aktiven v mnogih rakavih tkivih, v zdravih pa ne. Nosi zapis za apoptozni inhibitor survivin, ki je izredno pomemben za razvoj raka. Promotor tega gena je bil že uporabljen v kombinaciji s hTERT, torej v obliki hibridnega promotorja. Njegova uporaba se je odrazila v povečani transkiripcji genov, katerih prepisovanje je bilo regulirano s hibridnim promotorjem, in sicer timidne kinaze virusa Herpes simplex1 in mišjega granulocit-makrofag kolonijskega faktorja. Timidna kinaza pri tem deluje kot marker, ki ga celice imunskega odziva prepoznajo in zato uničijo celico, ki imajo izražen ta protein. Mišji granulocit-makrofag kolonijski faktor pa deluje imuno stimulatorno in tako ojača odziv imunskega sistema v tumorskem okolju. V obeh primerih so opazili upad v rasti tumorja.

Promotor gena za receptor s tirozin kinazno domeno 2 (Erb-B2)

Značilen je za približno četrtino primerov raka na dojki, pojavlja pa se tudi pri nekaterih drugih oblikah raka. Njegovo povečano delovanje se izrazi z zvišanjem števila tirozin kinaznih receptorjev ter posledično hitrejšo proliferacijo celic. Plazmid s tem promotorjem so uporabili v raziskavah prav v povezavi z rakom na dojki. Za promotor so vstavili gen za citozin deaminazo (z deaminacijo citozin pretvori v uracil), ki izhaja iz E. coli. Plazmid so injicirali neposredno v tumor, s tem pa so posredno aktivirali predzdravilo fluorocitozin, ki se lahko uporabi kot substrat za citozin deaminazo. Fluorocitozin so že pred tem injicirali v celice, da se je vgradil v tumorsko DNA. Citozin deaminaza ga kljub temu lahko prepozna in pretvori v fluorouracil. To vodi do mutacije v zgradbi DNA in napak pri replikaciji ter nastanka nefunkcionalnih proteinov, ki so sicer ključni za preživetje rakavih celic. Isti promotor so uporabili tudi v raziskavi, kjer je bila pod njegovim nadzorom timidinska kinaza virusa Herpes simplex-a. S tem je ganciklovir, zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje okužb z virusi Herpes in je bilo že predhodno vnešeno v organizem, postalo citotoksično za rakave celice s tovrstnim promotorjem, rast tumorja pa se je zaustavila.

Promotor tiroidnega transkripcijskega faktorja 1

Majhno, ampak konstantno izražanje tega promotorja najdemo tudi v zdravih pljučnih celicah, v večji meri pa se izraža pri pljučnem raku. Uporabili so ga kot promotor zapisa za miR-7 (mikroRNA-7) , ki deluje kot močan tumorski supresor tako, da se veže na mRNA in zaustavi translacijo. Injicirali so ga na od tumorja nekoliko bolj oddaljeno mesto, saj so s tem povečali možnosti uničenja potencialnih metastaznih celic, ob tem pa so opazili takojšnjo zmanjšano rast tumorja.

Promotor za prostato specifičnega antigena

Izražanje tega antigena v zdravem tkivu prostate je tako nizko, da je praktično zanemarljivo, veliko pogosteje pa ga najdemo v metastaznem raku prostate. Aktivnost tega promotorja lahko nadzorujejo DNA-vezavni proteini, sama regulacija pa je lahko odvisna od androgenov, moških spolnih hormonov. V primeru ene izmed raziskav so pod kontrolo tega promotorja v plazmid vstavili gen za perforin, ki naredi pore v celični membrani. Perforin je poškodoval membrane tumorskih celic in opaženo je bilo zmanjšanje tumorja, pri tem pa se zdravo tkivo ni skrčilo.

Proizvodnja protiteles

Monoklonska protitelesa, zapisana na vektorski DNA (DMAb) vse pogosteje uporabljajo za zdravljenje raka. Pri tem uporabljajo sintetične plazmide, ki zapisujejo gene DMAb in tako omogočajo hitro sintezo takšnih protiteles. Največja prednost pri tem je preprost proces proizvodnje takšnih plazmidov in njihov skokovit razvoj predvsem v zadnjih letih.

Primeri

Miši, ki so bile okužene s človeškimi celicami raka dojke, ki so na membrani imele tirozin kinazne receptorje (Erb-B-2), so zdravili s plazmidom, ki je kodiral anti-ErbB-2 DMAb. Rezultat takega zdravljenja je bil konstantno izražanje protiteles, ki so se vezala na Erb-B-2 in povzročila uničenje tumorskih celic. Protitumorski učinek je bil enak skoraj štirim odmerkom intravenoznega injiciranega protitelesa Herceptin, zaviralca Erb-B2 receptorja, terapevtski učinek pa je bil dolgotrajnejši. Podobno študijo so izvedli tudi pri raku prostate, z uporabo plazmida, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti prostati specifičnemu membranskemu antigenu (PSMA). Opazili so nadzorovano rast tumorja in preživetje miši, ki so bile zdravljene s tem plazmidom. Ta protitumorski učinek lahko poteka preko citotoksičnosti, odvisne od protiteles, tako da protitelesa sprožijo aktivnost naravnih celic ubijalk. Konstruirali so tudi sintetični plazmid, ki je kodiral monoklonsko protitelo proti CTLA-4 (zaviralec imunskega odziva). En sam odmerek tega plazmida je induciral izražanje protitelesa več mesecev. Poleg tega so opazili, da je zdravljenje s takšno DMAb povzročilo regresijo tumorja.

Vnos plazmidov v celice

Plazmidi, ki se uporabljajo za gensko zdravljenje, se običajno vnesejo neposredno v bližino tumorjev, kjer lahko delujejo na rakave celice. Lahko se jih vnese skozi sluznico, kjer prisotnost APC izboljša učinkovitost vnesenih plazmidov, ali z intramuskularnimi, intradermalnimi ali intratumoralnimi injekcijami za tarčno delovanje na rakave celice. Plazmide lahko v celice vnesemo z injiciranje ‘gole’ DNA, elektroporacijo, genskimi pištolami s pomočjo različnih nanodelcev ali v kompleksih z liposomi.

Najpreprostejša oblika vnosa plazmidov je z injiciranjem ‘gole’ DNA, ki naj bi učinkovala v približno polovici primerov. Za izboljšanje imunogenosti takega cepiva, je bilo predlagano injiciranje plazmidne DNA v bezgavke, kjer so poročali o 100-krat večji imunogenosti, kar je povzročilo močnejši imunski odziv (to so testirali na mišjem modelu raka).

Ena od najučinkovitejših metod vnosa plazmidne DNA je z elektroporacijo. Pri elektroporaciji z uporabo električnih impulzov povzročijo nastanek majhnih por na membrani, skozi katere lahko plazmidna DNA vstopi v celice. Tako kot pri injiciranju 'gole' plazmidne DNA v bližino tumorjev, tudi elektroporacijo izvajajo intratumorsko. V že opravljenih raziskavah, so poročali o lokalni migraciji APC, ki jo je povzročila elektroporacija, kar je omogočilo boljši odziv na zdravljenje.

Biolistika je alternativna tehnika vnosa novih genskih informacij v celice. Plazmidno DNA vnesejo z gensko pištolo. Ta deluje tako, da mikroskopske delce zlata, velikosti 1 do 4 µm, prekrite s terapevtskim DNA, z gensko pištolo izstrelijo z visoko hitrostjo proti rakavim celicam s pomočjo bata, ki deluje na stisnjen plin (npr. helij). V preteklih letih so primerjali tudi vnos plazmidne DNA z gensko puško z in brez zlatih delcev. Ta raziskava je pokazala učinkovit vnos DNA brez nosilca, njena prednost pa je bila odsotnost kožnih opeklin v primerjavi s konvencionalno tehniko ter zmanjšanje stroškov zdravljenja, saj ni bilo potrebno uporabiti zlatih delcev.

Lipofekcija je metoda vnosa genskega materiala v celice s pomočjo liposomov. To so lipidni vezikli, ki obdajajo notranje hidrofilne prostore, kamor se vgradi DNA. Liposomski kompleksi v celice vstopijo z endocitozo. Nastali endosom po vstopu v citoplazmo lahko razpade, plazmidna DNA pa se sprosti v citosol. Prednosti liposomskih kompleksov so manjša toksičnost, stabilnost kompleksov in izboljšana celična absorpcija. Zaradi negativnega naboja DNA in membrane pri fizioloških pogojih, se DNA največkrat kompleksira s kationskimi liposomi, kar izniči odboj med DNA in celično membrano ter tako omogoča sprejem kompleksa v celico. V različnih raziskavah so opazili spremenljivo učinkovitost vnešene plazmidne DNA z liposomskimi kompleksi v primerjavi z injiciranjem ‘gole’ plazmidne DNA.

Viri

1. Martínez-Puente DH, Pérez-Trujillo JJ, Zavala-Flores LM, et al. Plasmid DNA for Therapeutic Applications in Cancer. Pharmaceutics. 2022;14(9):1861. doi:10.3390/pharmaceutics14091861

2. Markovic M, Ben-Shabat S, Dahan A. Prodrugs for Improved Drug Delivery: Lessons Learned from Recently Developed and Marketed Products. Pharmaceutics. 2020;12(11):1031. doi:10.3390/pharmaceutics12111031

3. Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system. Int J Nanomedicine. 2012;7:2181-2195. doi:10.2147/IJN.S30197

4. Hall RS, Fedorov AA, Xu C, Fedorov EV, Almo SC, Raushel FM. The Three-Dimensional Structure and Catalytic Mechanism of Cytosine Deaminase. Biochemistry. 2011;50(22):5077-5085. doi:10.1021/bi200483k

5. Kaj delamo. Accessed May 12, 2024. https://www.onko-i.si/dejavnosti/raziskovalna_in_izobrazevalna_dejavnost/oddelek_za_eksperimentalno_onkologijo/kaj_delamo