Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

Izhodiščni članek: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents

Uvod

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov. Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1]. Molekule siRNA za terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Tudi obstaja tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti. Raziskovalci so pa razvili novo platformo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Ta platforma temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, ki omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA

Novo razvito človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule. tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA. Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA. Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice E. coli HST08 za fermentacijo. S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA). Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih. Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture E. coli (250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA. Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC. Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA). Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive. Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

Funkcionalno utišanje genov s siRNA

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

BioRNA/GFP-siRNA

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B). Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

BioRNA/BCL2-siRNA

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (angl. B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka. Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (angl. stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA. Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

BioRNA/PD-L1-siRNA Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (angl. programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1. Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

Zaključek

Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].

Literatura

[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 2024, 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol 2024, 13, 1906–1915.