Odkritje kratke interferenčne RNA (siRNA)
Pojem RNA interferenca (RNAi) sta prvič uporabila Andrew Z. Fire in Craig C. Mello s sodelavci, ki so odkrili, da lahko dvoverižna RNA (dsRNA), ki so jo vbrizgali v organizem C. Elegans, vpliva na izražanje genov, zraven tega pa ima tudi pomembno vlogo pri zaščiti genoma pred transpozoni in ponavljajočimi se sekvencami, služi pa lahko tudi kot obramba pred virusi. Domnevajo, da se je RNA interferenca razvila kot primitivni imunski odgovor na prisotnost tuje nukleinske kisline. Odkrili so jo že pri številnih glivah, rastlinah in živalih, vključno s sesalci.
Nadaljnja raziskovanja RNA interference so potekala na lizatu embrijev organizma iz rodu Drosophila. Pri raziskavah so uporabili so dve različni molekuli mRNA, ki sta bili radioaktivno označeni s 32P – mRNA za luciferazo meduze Renilla reniformis (Rr-luc) in kresničke Photinus pyralis (Pp-luc), ki si nista sorodna niti v zaporedju niti v specifičnem substratu luciferinu.
Vpliv ATP na RNA interferenco
V lizat so dodali ustrezno dsRNA in s pomočjo agarozne gelske elektroforeze spremljali, kaj se dogaja z Rr-luc mRNA. Ugotovili so, da RNAi poteka kot običajno. Nato so lizat tretirali z glukozo in heksokinazo in tako ATP pretvorili v ADP. Najprej so v lizat dodali tudi kreatin fosfat in kreatin kinazo, saj sta potrebna za regeneracijo ATP. RNAi je ponovno potekala nemoteno. Nato so poskus ponovili tako, da so prvič dodali le kreatin fosfat, drugič pa le kreatin kinazo, RNAi pa v nobenem primeru ni potekla, saj se ATP ni mogel obnoviti.
Podoben poskus so ponovili še s Pp-luc mRNA in dobili enake rezultate. Tako so ugotovili, da je za RNAi nujen ATP, niso pa še vedeli, v katerem koraku mehanizma.
Vpliv translacije mRNA
Potreba po ATP je nakazovala na to, da bi RNAi lahko bila povezana s translacijo mRNA, ki je energijsko potraten proces. V lizat so zato dodali razne inhibitorje sinteze proteinov, ki so zmanjšali translacijo za približno 1900x. Nato so dodali dsRNA, RNAi pa je potekala nemoteno. To pomeni, da na RNAi translacija mRNA nima vpliva, torej poteka na posttranskripcijskem nivoju.
Tvorba kratke interferenčne RNA (siRNA) in vpliv tarčne mRNA na njeno tvorbo
V lizatu so inkubirali 501bp dolgo Rr-dsRNA in 505bp dolgo Pp-dsRNA in s pomočjo poliakrilamidne gelske elektroforeze ugotovili, da se daljši verigi razrežeta na več krajših fragmentov, ki so dolgi 21-23 nukleotidov. Tak fragment pa imenujemo kratka interferenčna RNA (siRNA). Drugih stabilnih produktov ni bilo.
Poskus so ponovili prvič s tarčno mRNA, drugič pa brez in ugotovili, da ni bistvene razlike pri nastanku siRNA
Vpliv ATP na tvorbo siRNA
Ko so Pp-dsRNA inkubirali v lizatu, v katerem ni bilo prisotnega ATP, je sicer nastala siRNA, vendar 6x počasneje kot v lizatu, ki je bil tretiran z glukozo in heksokinazo, dodali pa so kreatin kinazo in kreatin fosfat. To pomeni, da za tvorbo siRNA ATP ni nujno potreben, jo pa pospeši.
RNA interferenca s protismerno RNA (asRNA)
mRNA so inkubirali v lizatu s pufrom, asRNA in dsRNA in analizirali s PAGE. V prvem primeru je ostalo 90%, v drugem 50% in v tretjem manj kot 5% stabilna mRNA. Tako so ugotovili, da protismerna RNA lahko vstopi v reakcijo RNAi, čeprav veliko manj učinkovito kot dsRNA.
Cepitvena mesta in cepitev mRNA
Vzeli so tri različne Rr-dsRNA (vsaka je bila približno 100 nukleotidov zamaknjena navzol iste mRNA) in jih inkubirali v lizatu z Rr-luc mRNA, nato pa analizirali s PAGE in ugotovili, da so nastali stabilni produkti mRNA, ki so ustrezali vsaki od treh dsRNA.
Nato so s pomočjo kartiranja 16 cepitvenih mest za te tri dsRNA ugotovili, da je 14 od 16 cepitev poteklo v intervalih 21-23 nukleotidov. Prva izjema je bilo cepitveno mesto, ki je bilo 32nt oddaljeno od naslednjega. Druga izjema: po štirih cepitvah, ki so potekle na intervalih 21-23nt, je sledilo cepitveno mesto le 9nt oddaljeno od prejšnjega (v tem segmentu je bilo 7 zaporednih uracilov), nato so cepitve spet potekale na intervalih 21-23nt.
Prav tako je 14 od 16 cepitev poteklo na uracilih.
Model mehanizma RNA interference
Po tem modelu se dsRNA najprej razreže na 21-23 nukleotidov dolge fragmente, ki se nato povežejo s specifičnimi proteini. Ločitev verig poteče s pomočjo od ATP odvisne reakcije s helikazo, kar razloži dejstvo, da ATP olajša nastanek siRNA. Po ločitvi obe verigi ostaneta povezani s proteini, kar pa razloži dejstvo, da je RNAi manj učinkovita, če v reakcijo vstopi le asRNA. Protismerna veriga se nato spari s komplemenarno regijo tarčne mRNA in nato povzroči eno ali kvečjemu dve cepitvi mRNA na 3' ali 5' koncu fragmenta siRNA.
Lahko bi prišlo tudi do ojačanja RNAi s specifično RNA polimerazo (kodirajo jo določeni geni pri organizmih C. elegans in Neurospora), kar omogoča dolgotrajno utišanje genov, ki je pri teh organizmih prisotno celo v naslednjih generacijah.
ATP bi lahko bil potreben v različnih korakih RNAi, vključno z nastankom siRNA, disociacijo verig, parjenjem asRNA in mRNA, cepitvijo mRNA ali za razgradnjo tarčne mRNA.
RNA interferenca pri sesalcih
Želeli so tudi raziskati, ali 21 nukleotidov dolg dupleks kratke interferenčne RNA(siRNA) zavre izražanje genov tudi v različnih celičnih linijah sesalcev, vključno s človeškimi ledvicami in Hela celicami. Kratka interferenčna RNA (siRNA) je tako postala novo orodje za proučevanje funkcije genov v celicah sesalcev.
RNA interferenco so najprej proučevali na insektih. Vendar pa dolgo ni bilo mogoče detektirati RNA interference v celičnih sistemih sesalcev, kot so človeške emrionalne ledvice, mišji fibroblasti, ledvice in jajčniki hrčkov. To je bilo nerazumljivo, saj so RNA interferenco že dokazali v mišjih jajčnih celicah in v zgodnjih zarodkih. Zato so z raziskavami želeli ugotoviti, ali kratka interferenčna RNA (siRNA) vpliva na degradacijo mRNA tudi v celičnih sistemih sesalcev. Poskus so izvedli s pomočjo kotransfekcije. Sintetizirali so 21 nukleotidov dolg siRNA dupleks s simetričnima 3´-koncema, ki sta bila dolga 2 nukleotida. Sintetizirani siRNA dupleksi so bili usmerjeni proti poročevalskemu genu za polip Renilla reniformis (RL) in dvema različicama luciferaze v kresničkah (GL2 in GL3). siRNA dupleks je bil kotransfektirani v obliki poročevalskega plazmida, kot kombinacija pGL2/pRL ali pGL3/pRL. Najprej so spremljali dogajanje v lizatih Drosophila, nato pa v celicah sesalcev. Luciferazna aktivnost je bila zaključena v 20 urah po transfekciji. V Drosophila S2 celicah je bila specifična inhibicija luciferaze zaključena in podobna predhodno pridobljenim rezultatom za daljšo dvoverižno RNA(dsRNA). V sesalskih celicah, kjer so poročevalski geni 50- do 100-krat močneje izraženi, pa specifična inhibicija ni bila dokončno zaključena. V mišjih fibroblastih in Hela S3 celicah je bilo izražanje GL2 zmanjšano za 3- do 12-krat, izražanje GL3 od 9- do 25-krat zmanjšano in izražanje RL zmanjšano za 2- do 3- krat. Zmanjšanjo izražanje je poteklo kot odgovor na sorodno siRNA. V človeških ledvicah je bilo delovanje RL luciferaze neučinkovito, čeprav je bil odziv na GL2 in GL3 specifičen. RL luciferaza je namreč v človeških ledvicah 5- do 20- krat bolj izražena kot v ostalih sesalskih celicah, dostopnost ciljne RNA pa je omejena tudi zaradi sekundarne strukture ali zvitja proteina. Kakorkoli, specifično delovanje GL2 in GL3 s sorodnim siRNA dupleksom je vendarle zadosten dokaz, da RNA interferenca poteka tudi v človeških ledvicah.
Želeli so tudi spremljati specifičen efekt utišanja pri različnih koncentraciji siRNA dupleksa. Najprej so pri kotransfekciji uporabili 25nM siRNA dupleks. Povečanje koncentracije siRNA na 100nM ni izboljšalo specifičnega utišanja, vendar pa je vplivalo na učinkovitost transfekcije, morda zaradi ovijanja liposomov med plazmidom DNA in siRNA. Zmanjšanje koncentracije siRNA na 1,5 nM prav tako ni zmanjšalo specifičnega utišanja, čeprav je bila koncentracija siRNA sedaj 2- do 20- krat večja od DNA plazmidov. Utiševalni efekt je izginil le takrat, ko je koncentracija siRNA padla pod 0,05 nM. To dokazuje, da je siRNA izredno močen reagent, ki povzroča utišanje gena.
S temi raziskavami so dokazali, da je siRNA aktivna tudi v celičnih sistemih sesalcev, vendar pa mehanizem 21-ih nukleotidov siRNA v procesu interference v celicah sesalcev ostaja neodkrit.
Viri
1. Zamore PD, et al. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 2000 Mar 31;101(1):25-33.
2. Elbashir SM et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.
3. Tuschl, T. et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999 December 15; 13(24): 3191–3197.
4. Wikipedia. RNA interference. 28.3.2012 [citirano 30.3.2012]
