INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI

Sintezna biologija omogoča inženiring bioloških naprav oz. sistemov z novimi ali izboljšanimi funkcijami. Tak pristop ima številne aplikacije, od proizvodnje številnih molekul, biogoriv do npr. zdravil. To se v principu doseže z inženiringom biokatalitičnih poti kjer so aktivnosti encimov skrbno koordinirane in vodijo v sintezo produkta, ki ga želimo. Delovanje velikega števila encimov je pogojeno s prisotnostjo kofaktorjev. Pri tem seminarju bom govorila o pomembnosti kofaktorjev za biokatalitične procese in s primeri skušala pojasniti zakaj je sinteza in integracija kofaktorjev pri tvorbi holoencimov pomembna pri inženiringu metaboličnih poti ter o izboljšavah, ki jih je omogočila sintezna biologija.

Pomen kofaktorjev v biologiji Za kofaktorje v širšem pomenu besede velja, da so povezani z več kot polovico znanih proteinov. V tem članku se izraz "kofaktor" nanaša le na tiste dele, bodisi organske ali anorganske, ki z encimom ostanejo fizično povezani skozi celoten katalitičen proces. To izključuje disocibilne kosubstrate, kot so NADPH in glutation. Poleg tega, saj je glavni poudarek članka na inženiringu biološke poti, velja omeniti le tiste kofaktorje, ki nastanejo po de novo poti. Tako so izključeni tudi kovinski subjekti, kot so kalcij in selen. Razvrščeni so v dve vrsti, na organske in anorganske. Organski kofaktorji so običajno derivati vitaminov in opravljajo številne vrste reakcij, medtem ko anorganski običajno temeljijo na različnih železo-žveplovih kombinacijah.

Holoencimi Veliko encimov je zgrajenih iz dveh delov: en del je beljakovinski (apoencim), drugi del pa nebeljakovinski (kofaktor). Celoten aktiven encim se imenuje holoencim. Če je kofaktor odstranjen, encim preneha delovati. Za sintezo holoencimov sta potrebna dva strukturna dela: polipeptidna veriga, ki se tvori v procesu translacije in kofaktorski del, katerega sintetiziramo po določeni metabolni poti. Ko je kofaktor sintetiziran, se poveže z apoencimom, bodisi v co-translacijskih ali post-translacijskih procesih, tvori se holoencim. Povezava koencim-apoencim je lahko kovalentna in v takih primerih se povezave običajno tvorijo preko serina, treonina histidina, tirozina in ostankov lizina in katalizirane preko določenega/različnih sistemov zorenja. Drugi način povezave koencim-apoencim je nekovalenten vendar močan. Težave Ključno za funkcionalen produkt holoencimov je, da je apoencim pravilno zvit s svojim kofaktorjem. Brez kofaktorjev, bi bili takšni encimi nefunkcionalni in s tem povezane poti bi postale neuporabne. To nezaželeno stanje je verjetno da nastopi pri pristopu pri mikrobnem inženiringu, kjer so lahko genetsko dobro okaraktizirane bakterije kot Escherichia coli popolnoma brez kofaktorjev, ki so potrebni za delovanje holencima. Druga možnost je, da so gostitelji sposobni sinteze zahtevanega kofaktorja, vendar pa je ta sinteza nezadostna, kar se kaže kot nabor encimov z visokim razmerjem Apo oblike v primerjavi s Holo obliko. Najbolj očitna strategija za rešitev teh problemov bi bil gensko spreminjanje gostitelja tako, da je sposoben tvorbe kofaktorja oz. da je stopnja sinteze nativno prisotnega kofaktorja zadostna. (1) Primeri: Poglejmo ekspresijo Fe hidrogenaze (HydA1) iz Chlamydomonas reinhardtii (zelena alga) v E.coli. Ta encim je odvisen od H-cluster, ki je v osnovi sestavljen iz 2 želez in treh ogljikovih monoksidov, dveh cianidnih ligandov in enega ditiolatnega mostička. Nastanek tega clustra katalizirajo trije encimi zorenja, HydE, HydF in HydG. Ker E. Coli ni zmožna sinteze encimov Hyd, vedno daje nefunkcionalno Fe-Fe hidrogenazo. To se lahko preprosto prepreči z dopolnitvijo izražanja Fe-Fe hidrogenaze HydA1 s potjo zorenja za H clouster in se tako tvori aktivno Fe-Fe hidrogenazo. V ekspresijski vektor so vnesli gene za hidrogenazo (HydA1) in za HydE, HydF, HydG v različnih kombinacijah (A1,;A1+EF, A1+ G; A1+EF+G). Le koekspresija HydA1 skupaj z vsemi tremi encimi, HydE, HydF in HydG, je dala aktivno hidrogenazo v E.coli. (2)

Pirolokinolin(PQQ) je še en primer kofaktorja, ki se naravno ne sintetizira v E. coli. Ta kofaktor iz družine kinoproteinov je potencialno uporaben za biogorivne celice, bioremodelacijo in biosensing. Z vključitvijo pqqABCDE cluster gena iz Gluconobacter oxydansa, so uspešno dokazali aktivnost dehidrogenazo D-glukoze v E. Coli, ki za svoje delovanje potrebuje PQQ. Cluster gen je bil najverjetneje dopolnjen z nativnim tldD genom. (3)

Tetrahidrobiopterin (BH4) je bistven kofaktor različnih encimov v sesalcih. In vivo se sintetizira iz GTP po tristopenjski poti s pomočjo GTP ciklohidrolaze I (GCHI), 6-piruvoil-tetrahidropterin sintaze (PTP) in sepiapterin reduktaze (SPR). Za razliko od višjih organizmov, večina mikroorganizmov vključno z E. coli nimajo BH4 biosintezne poti. E. coli, sicer ima GCHI gen folE, ki sodeluje v biosintezi folne kisline. Trenutno ga sintetiziramo s kemičnimi sredstvi, ki zahtevajo drage materiale in zapletene postopke in se raziskuje alternativne pristope. Za proizvodnjo BH4 so uporabili tehnologijo rekombinantne DNK v E.coli. Uporabili so različni ekspresijske plazmide z lac promotorjem ki so vsebovali folE gen iz E. coli, in cDNA gene jeter podgan ki izražajo PTP in SPR encime. Te sevi uspešno proizvajajo BH4, ki je bil odkrit kot dihidrobiopterin in biopterin, oksidacijski produkti BH4. Še dodatno so povečali aktivnost GTP ciklohidrolazo I da so gen folE iz E. coli nadomestili z mtrA gen iz Bacillus subtilis. S temi spremembami so pridobili 1,5x povečanje, do 4,0 g biopterina / L kulture. Rezultati kažejo, na možnost komercialne proizvodnjo BH4 s to metodo. (4) Vgraditev kofaktorja je ključnega pomena holoencimsko aktivnost Da bi bila specifična aktivnost holoencima maksimalna je treba dopolniti sintezo kofaktorja in/ali kofaktor vgraditi. Za encime, ki se s kofaktorjem vežejo na nekovalenten način, je postopek vezave kofaktorja še vedno uganka. Za tiste encime, ki se s kofaktorjem kovalentno vežejo, so se razvili specializirani sistemi zorenja, ki katalizirajo vstavljanje in kovalentno povezavo s kofaktorjem.

Indukcija sistema zorenja lahko poveča holoencimsko aktivnost, kot na primer karboksilne kislinske reduktaze (CAR), ki je bila pred kratkim uporabljena za proizvodnjo širokega spektra kemičnih proizvodov. CAR za svoje delovanje potrebuje kofaktor fosfopantetein. Ta kofaktor se med sintezo z encimom poveže preko fosfodiesterske vezi, kar omogoči encim zorenja, fosfopanteteinil transferaza. Ekspresija CAR v E. coli vodi k merljivim vendar izredno šibki aktivnosti. S soizražanjem fosfopanteteinil transferaze sfp iz Bacillus subtilis, se specifična aktivnost CAR za večkrat poveča v primerjavi z očiščenem encimom iz izvornega organizma. (5) Poleg stimulacije specifične encimske aktivnosti lahko izboljšamo produkcijo holenmcimov tudi s povečanjem znotrajceličnega nivoja kofaktorjev, na kar sklepamo iz razmerja med Holo / apo-oblike ter stopnje degradacije. Ta pojav je bil pogosto opažen pri hemoproteinih. Z dodatkom δ-aminolevulinske kisline k mediju, se poveča tvorba hema zato se tudi stopnja izražanja hemoglobina ter citokroma b5 znatno izboljša. (6) Spodbujanje sinteze kofaktorja lahko poveča hitrost sinteznih poti

V zvezi z dejanskim vplivom, ki ga ima lahko inženiring kofaktorjev na metabolno uspešnost sinteznih poti je omenjena naslednja študija. Za proizvodnjo prekurzorja vitamina C, to je 2-keto-L-gulonske kisline, so uporabili dve dehidrogenazi, ki sta odvisni od PQQ in D-sorbitol kot izhodni substrat. Ugotovili so, da inducirana ekspresija dehidrogenaz ni izboljšala titra nad določenim pragom, in postavili hipotezo da je PQQ omejujoč dejavnik. Hipoteza se je izkazala za pravilno, saj je indukcija poti za sintezo PQQ povzročila za 20% povečanje celotnega titra. (7) Zaključki • Zaradi pomembnosti sinteze in integracije kofaktorjev za aktivnost holoencimov je potrebno upoštevati nekaj ključnih točk pri sestavljanju bioloških poti, ki vključujejo holoencime: 1. Aktivnost holoencima je mogoča le znotraj gostitelja, ki je metabolično sposoben sintetizirat potreben kofaktor, drugače je potrebno izvesti komplementarno pot za proizvodnjo kofaktorja. 2. Da zagotovimo maksimalno aktivnost holoencima mora biti apoencim sklopljen s sintezo in insercijo potrebnega kofaktorja. Neuravnoteženost med tema dvema vodi v slabo aktivnost encima, ki je nezadostna za katalitične procese. 3. Ker je znano da kofaktor izboljša stabilnost in aktivnost holoencimov, je verjetno da bo inženiring kofaktorjev uporabna metoda za izboljšanje celokupne aktivnosti vseh holoencimov znotraj inženirane poti in s tem k tvorbi produkta ki ga želimo. (1)

Viri: 1. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways; Akhtar, Jones; 2014 2. Discovery of Two Novel Radical S-Adenosylmethionine Proteins Required for the Assembly of an Active [Fe] Hydrogenase; Posewitz; 2004 3. Pyrroloquinoline quinone biosynthesis in Escherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE gene cluster; Yang; 2010 4. Genetic engineering of Escherichia coli for production of Tetrahydrobiopterin; Yamamoto; 2003 5. Reduction of Carboxylic Acids by Nocardia Aldehyde Oxidoreductase Requires a Phosphopantetheinylated Enzyme; Venkitasubramanian; 2006 6. Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in Saccharomyces cerevisiae; Liu; 2014 7. Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol; Gao; 2014