Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije

Mikrobni konzorciji

Mikrobni konzorciji predstavljajo skupine različnih vrst mikroorganizmov, ki živijo v simbiozi. V naravi omogočajo izvajanje številnih zahtevnih procesov, tudi takih ki so za človeka zelo pomembni (npr. remediacija okolja, čiščenje odpadnih voda, prebava hrane v črevesju)<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref><ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>. Človek je že zelo hitro začel tudi sam izkoriščati lastnosti naravnih konzorcijev in jih načrtno selekcionirati za uporabo pri procesiranju piva in fermentaciji vina, v današnjem času pa predvsem za pridobivanje biogoriva in kovin<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Razvoj sintezne biologije je omogočil načrtovanje genetsko identičnih populacij z lastnostmi, ki omogočajo štetje, spomin in tvorbo vzorcev in jih povezujemo z večceličnimi organizmi<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Sintetična genetska vezja so nam tako dala vpogled v evolucijo, delovanje in lastnosti naravnih genetskih vezij, na podlagi česar lahko načrtujemo nove, sintezne konzorcije, ki so zmožni vršiti še bolj zahtevne naloge kot monokulture<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref><ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>. Njihova uporaba bi tako lahko imela velik potencial na področju varovanja okolja, biomedicine in energetike<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Mikrobni konzorciji v biorudarstvu

Biološki procesi pri pridobivanju kovin

Biorudarstvo je pridobivanje dragih in vsakdanjih kovin iz mineralnih rud ter odpadnih materialov z uporabo mikroorganizmov<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>. Razdelimo ga lahko v dva ločena procesa, bioizluževanje in biooksidacijo. Bioizluževanje se uporablja za pridobivanje kovin, kot so kobalt, baker in nikelj, pri čemer rude s kovinami med samim procesom raztopimo. V drugih primerih, predvsem pri pridobivanju zlata in ostalih dragih kovin, pa uporabimo proces bioksidacije. Pri tem mikroorganizmi odstranijo obdajajoče minerale, medtem ko kovine ostanejo obogatene v trdni fazi<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>4.

Bioizluževanje in biooksidacija delujeta na podobnih principih in posledično uporabljata podobne konzorcije mikroorganizmov4. Mikroorganizmi, ki omogočajo biorudarstvo , so večinoma avtotrofi, ki lahko preživijo v anorganskem in aerobnem okolju z nizkim pH, energijo pa pridobivajo z oksidacijo reduciranih oblik žveplovih in/ali železovih ionov<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>.

Mikroorganizmi oksidirajo minerale na različne načine. Za bioizluževanje sta bila najprej predlagana dva mehanizma, direktni in indirektni, kasneje pa so dokazali, da poteka le po indirektnem5. Zanj je značilno, da mikroorganizmi oksidirajo Fe2+ ione do Fe3+ ionov, kar lahko poteka na dva načina<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Pri nekontaktnem načinu planktonski mikroorganizmi oksidirajo Fe2+ ione v vodni raztopini, ki nato napadejo mineralno površino. Pri kontaktnem načinu pa imamo majhen reakcijski prostor med mikroorganizmom in mineralom, kjer se železovi ioni najprej skoncentrirajo v biofilmih, nato pa napadejo mineralno površino<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Intermediati in končni produkti, ki nastanejo pri obeh načinih, so odvisni od rude, ki jo izlužujemo<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref><ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>.

Komunikacija v naravnih biorudarskih konzorcijih

Da lahko mikroorganizmi učinkovito raztapljajo minerale, so se razvili različni načini medcelične komunikacije, ki vodijo v izražanje specifičnih genov, potrebnih za proces bioizluževanja. Najpomembnejši rezultat take komunikacije je tvorba biofilmov, ki je regulirana preko sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. quorum sensing - QS)6. Zaznavanje celične gostote je proces, v katerem celice komunicirajo med seboj z izločanjem in zaznavanjem signalnih molekul, imenovanih avtoinduktorji, ki vplivajo na različne celične procese7,8.

Največ raziskav tvorbe biofilmov je bilo narejenih na acidofilni, gram-negativni bakteriji Acidithiobacillus ferrooxidans, ki pridobiva energijo z oksidacijo železovih in žveplovih spojin ter je zato nekakšen modelni organizem za preučevanje bioizluževanja<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>9. Bakterija ima dva različna sistema zaznavanja celične gostote; prvi deluje preko acil homoserin laktonov (AHL), avtoinduktorjev tipa 1 (AI-1), drugi pa preko poti c-di-GMP<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Molekule AHL nastanejo z AHL-sintazo, ki je pravzaprav zapisana na dveh različnih operonih, ki se izražata glede na različne okoljske signale7. Operon afeIR vsebuje gena afeI in afeR, ki delujeta na enak način kot sistem Lux10. AfeI je AHL sintaza, AfeR pa transkripcijski regulator, ki se v dimerni obliki veže na zaporedje Lux9. Drug operon vsebuje štiri gene, glyQ, glyS, gph in act, ki zapisujejo α in β podenoto glicin tRNA sintetaze, fosfatazo ter aciltransferazo (AHL sintazo)7. Za AfeI in AfeR je značilno, da se močneje izražata v prisotnosti žvepla, Act pa v prisotnosti železa, kar pojasnjuje dejstvo, da lahko A. ferrooxidans razgrajuje tako žveplove kot železove minerale7.

Pot c-di-GMP v A. ferrooxidans je bila odkrita najkasneje, in sicer z analizo genomskega zaporedja pri preučevanju molekularnih mehanizmov tvorbe biofilmov<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>11. V njej ima glavno vlogo ciklični dimerni GMP (c-di-GMP), sekundarni prenašalec, ki z vezavo na efektorske komponente regulira številne celične procese12. Med drugim vpliva na izločanje zunajceličnih polimernih spojin (EPS) ter sintezo pilusov in bičkov, s čimer določa življenjski stil bakterij (planktonski ali v biofilmih)11,13.

Podobni mehanizmi komuniciranja so bili identificirani tudi v drugih vrstah bakterij (A. thiooxidans, A. caldus, A. ferrivorans, …), kar pomeni, da lahko med seboj komunicirajo celice istih ali različnih vrst bakterij<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>6.

Konzorciji naravnih in gensko spremenjenih bakterij

Uporaba mikroorganizmov pri pridobivanju kovin iz mineralnih rud oz. biorudarstvo se je v preteklih nekaj letih razvilo v uspešno in rastočo biotehnološko panogo, kljub temu pa je bila selekcija in spremljanje mikrobnih kultur za optimalno izluževanje minimalna<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>. Vprašanje torej ostaja, ali so trenutne mikrobne populacije v komercialnih postopkih dovolj primerne ali pa bi lahko z umetnim sestavljanjem bakterijskih sevov ustvarili še bolj učinkovite konzorcije<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>.

Raziskave so pokazale, da imajo konzorciji različnih bakterij, ki se nahajajo v naravi, večjo sposobnost izluževanja kot čiste kulture<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Razlog je v sinergijskih učinkih posameznih vrst bakterij, ki imajo sicer različne funkcije, a skupaj omogočajo izvajanje večstopenjskih procesov<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Mešana kultura A. ferroxidans in A. thiooxidans je npr. veliko bolj učinkovita pri izluževanju kalkopirita (mineral CuFeS2), saj A. thiooxidans preprečuje nastajanje inhibitornih jarozitnih plasti, ki so pogosto posledica sprememb v redoks potencialu<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Kombinacija avtotrofnih mikroorganizmov s heterotrofnimi acidofili, ki so sposobni odstranjevanja organskih spojin, je prav tako pokazala hitrejše procese izluževanja<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Številni primeri mešanih kultur mikroorganizmov tako nakazujejo, da so prednosti konzorcijev pri biorudarstvu predvsem povečana produkcija kislin, izboljšano pritrjevanje na mineralne površine, povečana rast in raven izluževanja<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Pri tem ima pomembno vlogo medcelična komunikacija<ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>.

Načrtovanje definiranih konzorcijev nam torej odpira nove možnosti za učinkovitejše bioizluževanje<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Pri tem lahko uporabimo enega izmed dveh načinov, pristop od zgoraj navzdol (ang. top down) ali pa od spodaj navzgor (ang. bottom up)<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>. Pri prvem načinu imamo v izhodišču mešanico različnih mikroorganizmov, s katerimi inokuliramo testni material in gledamo, kateri izmed njih bodo vzpostavili stabilen in učinkovit konzorcij<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>. Drugi način se od prvega izrazito razlikuje, saj pri tem na podlagi laboratorijskih meritev sestavljamo logično načrtovane konzorcije za izluževanje točno določene rude<ref name="ref3">Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).</ref>.

Pri umetnem sestavljanju konzorcijev lahko tako uporabimo mikroorganizme, ki že obstajajo v naravi, ali pa jih gensko spremenimo. Zaenkrat je več zanimanja namenjeno naravnim mikroorganizmom, saj je načrtovanje takih konzorcijev precej lažje, obenem pa tudi ne potrebujejo posebnih regulatornih dovoljenj<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Načrtovanje konzorcijev z gensko spremenjenimi mikroorganizmi je na drugi strani povezano s precej več izzivi<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Najprej je potrebno razviti metode za uvajanje genskih sprememb v genome mikroorganizmov, ki se trenutno še ne uporabljajo v laboratorijih<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>2. Poleg tega je v konzorciju potrebno zagotoviti dolgotrajno homeostazo, izvajanje želenih mikrobnih funkcij kljub možnemu horizontalnemu prenosu genov in medcelično komunikacijo<ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>.

Mikrobni konzorciji v bioremediaciji AMD

Ena izmed glavnih posledic rudarstva je odtekanje zakisane vode iz kovinskih rud (ang. acid mine drainage – AMD), ki vsebuje velike količine železa, aluminija in mangana, pa tudi nekaj toksičnih snovi, kot so cianidi in težke kovine<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>14. Do tega lahko pride, ko so sulfidni minerali, najpogosteje pirit (FeS2), izpostavljeni kisiku in vodi15. Če se torej odpadne vode, ki nastanejo v procesu izluževanja, pred izpustom v okolje ne očistijo, pride do onesnaženja vodnih poti, sprememb v biodiverziteti in ogroženosti človeškega zdravja14.

AMD se večinoma preprečuje na dva načina, z nevtralizacijo odpadnih voda po izluževanju ali pa med procesom izluževanja<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. V industriji se trenutno uporablja nevtralizacija z apnencem, ki je razmeroma drag proces, zaradi česar so mikroorganizmi, ki so zmožni bioizluževanja in tvorbe biofilmov, postali zanimiva tarča za nadzorovanje AMD<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Bioremediacijo AMD omogočajo mikroorganizmi, ki lahko imobilizirajo kovine in povišajo pH okolice15. Procesi, ki so za to potrebni, so večinoma redukcijski in zajemajo denitrifikacijo, amonifikacijo, metanogenezo ter redukcijo sulfata, železa in mangana15.

Veliko pozornosti je poleg bioremediacije namenjeno tudi potencialnim načinom omejevanja AMD z uporabo mikroorganizmov. Eden izmed načinov je uporaba heterotrofnih acidofilov, ki obdajo pirit in tvorijo biofilm (ang. bioshrouding), pred dodatkom drugih bakterij. Na ta način se na odpadne minerale, ki nastanejo po raztapljanju rud pri bioizluževanju in ne vsebujejo kovin, ne morejo vezati kasneje dodani avtotrofni acidofili in z oksidiranjem železa povzročiti dodatne zakisanosti16. Drug potencialen način je uporaba evkariontskih organizmov (alge, glive), ki izločajo motilce QS, kar vodi v nepravilno medcelično signalizacijo in posledično moteno nastajanje biofilmov<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Tretji predlagan način je uporaba spremenjenih bakteriofagov in virusov, ki po okužbi celic prav tako ovirajo tvorbo biofilmov. Pri načrtovanju takih virusov je sicer potrebno paziti, da so le-ti zmožni obiti bakterijske obrambne mehanizme, kot je CRISPR/Cas<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Prihodnost mikrobnih konzorcijev

Možnost ustvarjanja in manipuliranja mikrobnih konzorcijev omogoča višjo raven pridobivanja kovin iz mineralnih rud v procesu biorudarstva v primerjavi s konzorciji, ki trenutno obstajajo v naravi<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>. Poleg tega lahko na ta način okarakteriziramo raznolike vrste v bioizluževalnih okoljih, ki imajo morda edinstvene metabolne in fiziološke lastnosti, a še niso bile predmet podrobnejših raziskav<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref>.

Glede na to, da lahko konzorciji opravljajo veliko bolj zahtevne naloge kot monokulture in lažje preživijo v spreminjajočih se pogojih, se bo njihova uporaba v prihodnosti zagotovo razširila tudi na nekatere druge industrijske panoge, okoljevarstvo in zdravstvo<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref><ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>. Predtem bo potrebno razviti še metode za stabilno transformacijo organizmov, ki so sicer manj dovzetni za gensko manipulacijo, ter izpopolniti medcelično komunikacijo za popolnoma usklajeno delovanje mešanih populacij<ref name="ref1">Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).</ref><ref name="ref2">Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).</ref>.

Viri

1. Brune, K. D. & Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front. Microbiol. 3, 1–6 (2012).

2. Brenner, K., You, L. & Arnold, F. H. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology. Trends Biotechnol. 26, 483–489 (2008).

3. Rawlings, D. E. & Johnson, D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153, 315–324 (2007).

4. Johnson, D. B. Biomining—biotechnologies for extracting and recovering metals from ores and waste materials. Curr. Opin. Biotechnol. 30, 24–31 (2014).

5. Brierley, C. L. et al. Biomining. Theory, Microbes and Industrial Processes. (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1997). doi:10.1007/978-3-662-06111-4

6. Ruiz, L. M. et al. AHL communication is a widespread phenomenon in biomining bacteria and seems to be involved in mineral-adhesion efficiency. Hydrometallurgy 94, 133–137 (2008).

7. Rivas, M., Seeger, M., Jedlicki, E. & Holmes, D. S. Second Acyl Homoserine Lactone Production System in the Extreme Acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3225–3231 (2007).

8. Keller, L. & Surette, M. G. Communication in bacteria: an ecological and evolutionary perspective. Nat. Rev. Microbiol. 4, 249–258 (2006).

9. Farah, C. et al. Evidence for a functional quorum-sensing type AI-1 system in the extremophilic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7033–7040 (2005).

10. Rivas, M., Seeger, M., Holmes, D. S. & Jedlicki, E. A Lux-like quorum sensing system in the extreme acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. Biol. Res. 38, 283–297 (2005).

11. Ruiz, L. M., Castro, M., Barriga, A., Jerez, C. A. & Guiliani, N. The extremophile Acidithiobacillus ferrooxidans possesses a c-di-GMP signalling pathway that could play a significant role during bioleaching of minerals. Lett. Appl. Microbiol. 54, 133–139 (2012).

12. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 7, 263–273 (2009).

13. Tamayo, R. The characterization of a cyclic-Di-GMP (c-Di-GMP) pathway leads to a new tool for studying c-Di-GMP metabolic genes. J. Bacteriol. 195, 4779–4781 (2013).

14. Akcil, A. & Koldas, S. Acid Mine Drainage (AMD): causes, treatment and case studies. J. Clean. Prod. 14, 1139–1145 (2006).

15. Johnson, D. B. & Hallberg, K. B. Acid mine drainage remediation options: A review. Sci. Total Environ. 338, 3–14 (2005).

16. Johnson, D. B., Yajie, L. & Okibe, N. ‘Bioshrouding’: a novel approach for securing reactive mineral tailings. Biotechnol. Lett. 30, 445–449 (2008).