Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije

1. Uvod

Evkariontske celice so visoko komparmentizirane zato predstavljajo oviro za uporabo genskih mrež. Večina genskih mrež je izražena preko plazmidov, vendar pa lahko te genetske konstrukte vstavimo v kromosom ohranjenih celičnih linij, z uporabo rekombinaznih tehnik, s čimer se ustvarijo stabilne celične linije (Kis in sod. 2015). Ko se je sintezna biologija izkazala primerna tehnika za uporabo v evkariontskih celicah, so začeli dodajati nova ogrodja v že obsotoječi tehnologiji, vključno s spremembo signalnih poti (v povezavi s boleznimi), novih pristopov na ravni genov in terapij, ki vključujejo vnos spremenjenih celic (Kis in sod. 2015).

2. Sistemi vezij, ki se uporabljajo pri sesalskih celicah

Najboljše je stikalo med dvema diskretnima stanjema: ON in OFF, stikala glede na vhodni signal vključijo ali izključijo določen proces (Kis in sod. 2015). Stikala so naredili na podlagi transkripcije, posttranskripcije, translacije in postranslacije, ki so glavni koraki pri prepisu gena do funkcionalnega proteina (Kis in sod., 2015).

3. Sintezne genske mreže v sesalskih celicah

Leta 2004 so bila narejena Booleanova logična vrata NOT, OR in AND s kombinacijo heterogenih transkripcijskih faktorjev. Narejena so bila tudi Booleanova logična vrata na podlagi cinkovih prstov in CRISPR/Cas9 sistem. Slednji se je izkazal kot zelo preprost za uporabo (Kis in sod. 2015).

4. Transkripcijska stikala

Pri genskem izražanju kot prva stopnja nastopi transkripcija. Za potencialni transkripcijski biosenzor (transkripcijsko stikalo) tako potrebujemo ustrezno RNA polimerazo, promotor, transkripcijske faktorje in druge dejavnike, ki sodelujejo pri prepisu. Večina vezij je narejenih s pomočjo že znanih bakterijskih promotorjev, lac, tet in ara operonov (Khalil in Collins, 2010). Z namenom narediti gensko vezje in tako doseči programirane transkripcijske spremembe transkripcijsko stikalo sestoji iz okoljskega- odzivnega promotorja (Jain K, 2013).

5. Postranskripcijska stikala

Sledi postranskripcija, kjer se pre-mRNA pretvori v zrelo mRNA. Tako narejeno stikalo kontrolira funkcijo in stabilnost molekule mRNA. Naredili so TetR stikalo, ki regulira izražanje shRNA (kratka lasnična RNA) preko doksiciklina, rezultat pa je, da shRNA kontrolira izražanje transgena in vivo in in vitro. Postranskripcijska stikala so lahko narejena tudi s aptameri. To so majhne enoverižne nukleinske kisline z visoko afiniteto in specifičnostjo za tarčne molekule, ki zavirajo njihove biološke funkcije. Gensko izražanje je lahko regulirano preko kontrole mRNA spajanja preko uporabe ustreznega aptamera (Kis in sod. 2015). Aptamer (senzor) skupaj z ribocimom (aktuator) tvorita aptazim (alosterični ribocim). Ribocimski del je del RNA molekule z encimsko funkcijo, ki je zmožen katalizirati specifične biokemijske reakcije. Ti aptazimi lahko delujejo kot postranstkripcijsko stikalo. Z vključitvijo aptazima na N ali C-konec neprepisane mRNA molekule, lahko stukturni elementi, ki so prisotni na koncih padejo iz verige, od liganda odvisnim načinom in pride do kontoliranega utišanja genov (Kis in sod. 2015).

6. Translacijska stikala

Naslednji korak v procesu je translacija. RNA molekula ima številne pomembne celične funkcije. Nekodirajoče RNA lahko spajajo in urejajo mRNA, modificirajo ribosomalno RNA, katalizirajo številne biokemijske reakcije in regulirajo gensko izražanje na ravni transkripcije ali translacije (Khalil in Collins, 2010). Ravno nekodirajoče RNA molekule so primerne za translacijska stikala. Primer takih so lahko ribostikala oziroma ribosomska stikala , ki so narejena s pomočjo aptamera, preko katerega vežejo specifično molekulo in povzročijo konformacijsko spremembo na mRNA molekuli in s tem povzročijo inhibicijo translacije (OFF stikalo) (Khalil in Collins, 2010).

7. Postranslacijska stikala

Kot zadnji korak sledi posttranslacija v funkcionalen protein. Stikala so narejena tako, da vsebujejo vhodni signal receptor, ki sproži signalno pot. Te signalne receptorje lahko naredimo de novo (Khalil in Collins, 2010). Proteinski receptorji so ponavadi vezani na membrano in preko vezave ustreznega proteina sprožijo ustrezno signalno kaskado (Khalil in Collins, 2010). Prav tako so razvili stikala, ki kontrolirajo proteinsko sortiranje ( Kis in sod. 2015).

8. Sintezna bilogija in napredne medicinske aplikacije

Naredili so gensko mrežje za sledenje celici, ki je izpostavljena določenemu držljaju; doksiciklinu in UV sevanju. Tako lahko kontroliramo izražanje transkripcijskega faktorja, preko pozitivne povratne zanke. To vezje lahko spremeni izražanje genov, rast celic in preživetje celic več generacij po določenem dražljaju in tako tudi novo diagnostično in terapevtsko okno (Kis in sod. 2015). Če bi to gensko mrežje preko toggle stikal vstavili v imunske celice, ki se selijo, bi preko tega lahko spremljali lokacijo hipoksične regije nedelečega tumorja ali ateroskleroznega tkiva (Kis in so. 2015). Razvili so tudi bolj razvite sintetične genske mreže, ki so v povezavi z nativnim celičnim signaliziranjem. Tako so razvili RNA “nadzornike” (angl. controllers), ki prepoznajo prirojeno signaliziranje preko jedrskega faktorja κB in Wnt signalizacijo in spremenijo to signalizacijo in tako ustvarijo novo alternativno RNA spajanje (Kis in so. 2015). Tudi endogene celice je moč uporabiti kot terapevtske agente. T limfociti, ki nastanejo iz timusa, so tip belih krvnih celic, ki imajo pomembno vlogo pri celični imunosti, še posebaj kot odgovor na določen patogen. Človeške T celice so pomembne tarče sintezne biologije, saj so lahko iz pacienta izolirane, gensko sprememenjene in nato zopet vstavljene nazaj v pacienta. To lahko uporabimo za študije kroničnih obolenj ali raka (Kis in sod. 2015). Na zdravilo odzivno RNA stikalo so naredili za kontrolo izražanja citokina v miši, ki uravnava T- celično poliferacijo. V tem sistemu so vhodni signali ligandi in regulatorne tarče, ki jih uporabimo v terapevske namene. Taka vezja lahko uporabimo za zdravljenje oziroma terapijo proti levkemiji (Kis in sod. 2015). Prav tako so bila narejena RNA stikala preko katerih se lahko soočimo s številnimi rizičnimi faktorji kardiovaskularnih bolezni (Kis in sod. 2015).

9. Sintezne genske mreže za bakterijsko odpornost na antibiotik

Velik napredek pri molekularni biologiji in genskem inženiringu je sposobnost sintetizirati, oblikovati in spreminjati bakteriofage. To je omogočilo nova orodja, ki temeljijo na bakteriofagih gnih orodjih, ki se uporabljajo za zdravljenje nekaterih nalezljivih bolezni, v kontekstu sintezne biologije (Kis in sod. 2015). Fagni zaslon, ki vključuje fuzijo naključnih peptidnih knjižnic je prinesel velik napredek na področju cepiv in odkrivanju novih zdravil, s posebnimi aplikacijami za upravljanje s Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus in Bacillus anthracis. Tako so bila narejena vezja s terapevtskim in diagnostičnim ozadjem, ki so jih razdelili v antimikrobna in antibiotična vezja. Prva temeljijo na T7 in M13 fagih, slednja pa uporabijo fage kot podvozje in generirajo biokemijski odgovor na antibiotike (Kis in sod, 2015).

10. Sintezne genske mreže in odkrivanje zdravil

Proti tuberkulozi so naredili vezje z antibiotikom entionamidom, ki je toksičen proti Mycobacterium tuberculosis, preko aktivatorja EthA. EthA je zavrt preko represorja EthR. V vezju je EthR fuziran s transaktivatorjem VP16 iz virusa Herpes simplex, ki se veže na Pmin promotor in s tem aktivira reporterski gen SEAP (človeška placentna sekrecijska alkalin fosfataza). S pomočjo tega so določili EthR inhibitorje, ki lahko odpravijo odpoornost na entionamid (Khalil in Collins, 2010). V študiji leta 2014 so se poleg številnih drugih vezij osredotočili tudi na biosenzor za ubijanje rakastih celic. Zaradi nenadzorovane celične delitve in širjenja v druge organe, predstavlja rak dandanes velik problem pri odkrivanju zdravil in pri zdravljenju. Eden ključnih izzivov pri zdravljenju raka je odstranitev celic brez poškodbe zdravih okoliških tkiv (Ye in Fussenger, 2014). Nissim in sod. so razvili takšen biosenzor, ki ubije rakasto celico. Senzor je sestavljen iz dveh vhodnih signalov, transkripcijskih faktorjev TF1 (DocS-VP16) in TF2 (Coh2-Gal4), pod dvema sorodnima promotorjema. S tem ko transkripcijska faktorja heterodimerizirata nastane nov transkripcijski factor (Gal4-Coh2-DocS-VP16). Ta aktivira HSV-TK (timidin kinaza iz virusa Herpes Simplex), ki nato pretvori ganciklovir v toksično snov in ubije rakasto celico (Ye in Fussenger, 2014). Membranski receptorji so prav tako pomembne tarče za odkrivanje zdravil. Eden pomembnejših membranskih receptorjev je z G proteinon sklopljen receptor (GPCR), ki se največrat uporablja kot ključni marker v moderni medicini (Kis in sod. 2015). Od 100 poznanih GPCR jih vsaj 50 uporabljajo kot tarče pri odkrivanju zdravil v farmaciji (Kis in sod. 2015).

11. Zaključek

Sintezna biologija sesalskih celic bi lahko doprinesla veliko k diagnostniki, zdravljenju bolezni in odkrivanju novih zdravil. Z novim in še bolj obsežnejšim raziskovanjem bi lahko še bolj napredovali in določene dosedanje pomankljivosti izboljšali. Uporablja se že pri terapiji kardiovaskularnih bolezni, raku in celični imunosti.

11. Viri

1. Kis Z, Pereira HSA, Homma T, Pedrigi RM, Krams R. 2015 Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J.R.Soc.Interface12, 2014. 2. Ahmad S. Khalil* and James J. Collins. Synthetic Biology: applications come of age. Nature reviews Genetics. Volume 11. 367-379. Maj 2010. 3. M.K. Pastuszka in J.A. Mackay. Biomolecular engineering of intracellular switches in eukaryotes. NCBI. 2010 May; 20(3): 163–169. 4. Haifeng Ye in Martin Fussenegger. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. Science Direct. Volume 588. Issue 15. Avgust 2014, 2537-2544.