Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R
Odkritje proteaze SAPFL
Proteaze predstavljajo kar 65% trga z encimi. Nove encime uporabne v industriji je najpreprosteje odkriti v neraziskanih delih sveta. Potencialno zanimiv so zato ekstremofilni mikroorganizmi, ki za svoje preživetje potrebujejo encime z edinstvenimi lastnostmi. Tako so ob raziskovanju Tunizijskih črpališč nafte odkrili tudi proteazo, poimenovano SAPFL. Prednost tega encima je možna uporaba v prisotnosti detergentov, ki se v industriji uporabljajo pri obdelavi materialov. V vzorcih vode iz črpališč nafte so odkrili 4 bakterije, ki so kazale proteolizno aktivnost. Proteazo SAPFL so izolirali iz seva Bacillus licheniformis, ki je kazal sposobnost razgradnje nafte v vodi. Optimizirali so količino izoliranega proteina s spremembo vira ogljika in dušika ter spremebo 4 drugih parametrov. Proteazna aktivnost je bila izmerjena z modificirano Petersonovo metodo. Test proteazne aktivnosti je bil narejen po metodi po Touioui Boulkour in sod.
Čiščenje proteaze in encimski testi
Sledilo je čiščenje proteaze. Uporabili so supernatant po centrifugaciji celične kulture. Tega so termično obdelali na 80°C in nato ob dodatku naraščajočih koncentracij amonijevega sulfata precipitirali. Ponovno so ga raztopili v pufru MOPS. Raztopino so nato analizirali z metodama FPLC in HPLC. Sledila je SDS-PAGE in analiza aminokislinskega zaporedja. Rezultati so pokazali, da je izoliran encim monomeren protein z 27 aminokislinskimi ostanki. Raztopina je vsebovala malo primesi in je bila zato primerna za nadaljno analizo. Sledile so raziskave vpliva inhibitorjev, reducentov in kovinskih ionov na encimsko aktivnost. Testirali so DFP, PMSF, SBTI, TLCK, TPCK, DTNB, NEM, jodoacetamid, leupeptin, pepstatin A in EDTA. Inhibicija z DFP in PMFS je pokazala, da spada odkrita proteaza med serinske proteaze. Dodatek EDTA in soli z različnimi kovinskimi ioni je pokazala pomen prisotnosti Ca, Fe in Zn dvovalentnih ionov pri encimski funkciji. Določili so tudi optimalni pH in temperaturo za delovanje in shranjevanje proteaze. Optimalna temperatura delovanja je bila 70°C, optimalen pH pa 11. Ti številki kažeta dobro odpornost proteaze. Odpornost pri visokih temperaturah pa se lahko še poveča z dodatkom poliolov, kot so PEG 1000, 1500, 6000, glicerol in ksilitol. Kinetične lastnosti encima so testirali skupaj s 4 drugimi encimi na dveh substratih: kazein in sintetični peptid Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Vrednosti k(cat)/K(m) pri SAPLF so bile 2 do 7 krat večje v primerjavi z drugimi encimi. Ključen dosežek raziskave je bil test stabilnosti ob prisotnosti pralnih detergentov. Proteaza SAPFL je pokazala zelo dobro ohranitev proteazne funkcije ob dodatku detergentov. V primerjavi s kontrolo (proteaza brez dodanega detergenta) je aktivnost znašala od 75 do 84 %, odvisno od znamke uporabljenega detergenta. Da bi še dodatno pokazali uporabnost encima kot dodatka k detergentom, so raziskovalci iz Tunizije naredili test odstranjevanja krvnih madežev iz bombaža. Proteinski madeži, kot je krvni madež na kosu oblačila, so vedno predstavljali težave pri čiščenju. Poskus je pokazal, da madež ob dodatku SAPLF hitro izgine, medtem ko ga sam detrgent ne odstrani. Proteaza SAPLF je pokazala tudi boljše lastnosti v primerjavi z »Alcalase Ultra 2.5 L«.
