Mehanizem delovanja rifamicinov
Uvod
Rifamicini so skupina antibiotikov, sintetizirani s strani bakterijskega seva Amycolatopsis rifamycinica, poimenovan na podlagi 16S ribosomskega RNA zaporedja. Zaradi edinstvene strukture, v kateri je aromatska struktura naftalena ali benzena umeščena v večjo ciklično strukturo, jih uvršamo v družino ansamicinov. Na podlagi načrtnih mutagenez v procesu fermentacije je bilo mogoče izolirati številne rifamicinske spojine tudi z drugih bakterijskih rodov, kot je A. mediterranei.
Rifamicinske substance so bile prvič izolirane leta 1957 iz kulture Streptomyces mediterranei s strani Sensi et al., v okviru česar so bili odkrite molekule rifamicina A – E. Kljub nizki aktivnosti je bila enostavna pretvorba rifamicina B v veliko aktivnejši derivat rifamicin SV, najbolja raziskan rifamicinski produkt, ki je zaradi svoje uporabnosti svojo vlogo v zdravstvu dobil tudi kot intravenozni antibiotik.
Rifamicini v osnovi delujejo tako, da inhibirajo RNA-polimerazo in s tem bakterijam preprečijo transkripcijo genov, kar posledično zmanjša sintezo za bakterijo nujnih proteinov in vodi v njihovo smrt. Rifamicini so dovolj specifični, da inhibirajo le bakterijsko RNA-polimerazo, ne pa tudi evkariontske, zato niso nevarni za človeške celice.
Preučevanje delovanja rifamicinov
Le nekaj let po odkritju rifamicinov je bil na podlagi inhibicije sinteze proteinov pri bakteriji Bacillus subtilis predpostavljen njihov antibiotski učinek, prvič opažen v obliki močne inhibicije v sintezni poti uracila. Raziskava s strani Hartmann et al. je prikazala še izrazitejšo rifamicinsko inhibicijo absorbcije uracila v bakterijskih sevih Staphylococcus Aureus, na podlagi česar je bila predpostavljena interferenca rifamicinov na normalno delovanje RNA sinteze. Pripadajoči eksperimenti so dokazali inhibicijo od DNA odvisne RNA polimeraze E. coli že pri nizkih koncentracijah reda 10-8M. Na drugi strani pa so antibiotsko predpostavko pod vprašaj postavila odkritja, ki so prikazovala, da tak učinek ni bil razviden v drugih bakterijskih sistemih kot sta Escherichia coli ali B. stearothermophilus.
V nadaljnjih preiskavah učinkov rifamicinov na sintezo proteinov preko RNA polimeraze so bile uporabljene poli d(A – T) in poli d(G) + poli d(C) matrice, na podlagi katerih je bil dokazan jasen inhibitorni učinek s pomočjo govejih interferenčnih DNA. Ob prisotnosti 0,25 µg/ml koncentracije rifamicina B se je samo 18% nukleotidov priključilo RNA. Med različnimi rifamicinskimi antibiotiki sta se rifampicin in 3-morfolino rifamicin SV izkazala za najbolj učinkoviti spojini, katerih koncentracija 2×10-8M je zadostovala za preprečitev 50 % encimske aktivnosti RNA polimeraze. Za primerjavo lahko navedemo aktinomicin, najpogosteje uporabljan antibiotik pred uvedbo rifamicinov, od katerega so rifamicinske spojine delovale kar 10-krat učinkoviteje. V nasprotju z RNA polimerazo, sinteza DNA usmerjajoče DNA ni zmanjšana niti pri višjih koncentracijah. Takšno, v svetu bakterij sicer neobičajno specifično delovanje proti RNA polimerazi je bilo najdeno pri vseh testiranih rifamicinih, kar nakazuje na drugačen sistem delovanja od večine znanih inhibitorjev sinteze nukleinskih kislin, kot sta aktinomicin in kromomicin, ki inhibirata DNA in RNA polimerazi s sintezo komplementarne DNA matrice. To nakazuje na rifamicinsko aktivnost brez blokiranja RNA sinteze na podlagi interference z matrico. V nasprotnem primeru bi bila DNA polimerazna reakcija bolj dovzetna za njegovo delovanje, iz česar sledi, da rifamicini ne delujejo na samo nukleinsko verigo ampak vplivajo direktno na aktivnost RNA polimeraze. Na podlagi tega so bile na bakterijskih sistemih E. coli in B. subtilis opravljene raziskave, ki so jasno nakazale inhibicijo RNA sinteze kot primaren mehanizem delovanja rifamicinov, na podlagi česar je njihovo učinkovanje na proteine preko DNA sinteze le posledica vezave ter posledično delne inhibicije RNA sinteze.
Vezava na RNA polimerazo
Rifamicini lahko skozi membrane in celične stene prehajajo med celicami, zato so učinkoviti tako proti gram negativnim kot tudi gram pozitivnim bakterijam. Za svoje delovanje se morejo prebiti do RNA- polimeraze v citoplazmi, kjer s pomočjo svojega mehanizma inhibirajo transkripcijo. Rifamicini se vežejo med strukturni domeni 3 in 4 na beta podenoti RNA-polimeraze. Vezava poteka v kanal, kjer RNA po končani sintezi izhaja in torej ne direktno v aktivno mesto encima (od tega je oddaljen 12,1Å) kot to opisujejo nekateri viri, ki navajajo njegovo interakcijo z magnezijevim ionom v aktivnem mestu. Z beta podenoto RNA-polimeraze se rifamicin močno poveže na podlagi več vodikovih vezi ter van der Waalsovih interakcij. Zaradi različne aminokislinske sestave beta podenot RNA-polimeraze pri bakterijah se število vezi ter posledično moč vezave razlikuje. Na podlagi samega števila vezi med komponentama bi lahko sklepali na stabilno vezavo, pri čemer in vitro zamenjava samo ene aminokisline v bakterijski RNA-polimerazi lahko prepreči njuno povezavo, kar posledično razvije bakterijsko odpornost na antibiotik. Evkariontska RNA polimeraza se tako strukturno kot po aminokislinskem zaporedju dovolj razlikuje od prokariontske, kar onemogoča vezavo rifamicinov na beta podenoto in s tem inhibicijo sinteze proteinov, kar narekuje njihovo nevtralnost za zdravje človeških celic.
Mehanizem inhibicije transkripcije genov
Vezava na beta podenoto torej prepreči transkripcijo bakterijskih genov. Ker rifamicinski antibiotik ni vezan v aktivno mestu lahko v njem pride do začetka transkripcije, ki se izkazuje kot vezava RNA-polimeraze na promotor. Pri tem je zanimivo, da se kinetika (ali Km) vezave začetnega nukleotida ob sintezi RNA z vezanim rimaficinom, v nasprotju z pričakovanim, poveča celo za dvakrat. Povezavi prvega na nastajajoč transkript sledi vezava drugega nukleotida z pomikom začetnega nukleotida na pozicijo -1. Sinteza se zatakne pri tretjem nukleotidu z vezanim trifosfatom, kjer nahajanje antibiotika na poziciji -2 v encimu predstavlja sterično oviro, kar onemogoča premik začetnega nukleotid na to pozicijo. Posledično je onemogočen vstop tretjega nukleotida v aktivno mesto; tako fosfodiesterska vez med drugim in tretjim nukleotidom ne nastane in sprosti se 2 nukleotida dolg transkript. Kot izjema se v primeru vezave nukleozida z manj fosfatnimi skupinami tvori še dodatna fosfodiesterska vez in do terminacije transkripcije pride šele ob poizkusu vezave četrtega nukleotida, kar efektivno pripomore k povečanju transkripta z 1 nukleotid. Mehanizem vezave dodatnega nukleotida z manj fosfati še ni pojasnjen, saj razlika v velikosti nukleotidov na podlagi primanjkljaja fosfata ni tako znatna, da bi bila vezava le-tega v aktivno mesto polimeraze manj sterično ovirana.
Uporaba in biosinteza
Rifamicini so še posebej učinkoviti proti micobakterijam, ki so med drugim povzročitelji tuberkuloze, gobavosti in obilice ostalih bolezenskih stanj. Ker rifamicinski antibiotiki v osnovi ne škodujejo našim celicam, so bili v preteklosti pogosto uporabljeni v zdravstvene namene. V preteklosti je bil najpogosteje zastopan že omenjeni rifamicin SV, ki pa ga z novejšimi genskimi tehnologijami ni bilo mogoče optimirati. Tako je bil po kliničnih testih nadomeščen z rifampicinom, ki ga odlikujejo boljše antibiotske lastnosti ter izjemno učinkovita biosintezna pot.
Začetki razumevanja biosintezne poti rifamicinskih antibiotikov temeljijo na podatkih NMR spektroskopije, ki je odgovorila na vprašanje o izvoru posameznih C-atomov v teh molekulah. Na podlagi tega je bila za izhodno molekulo najdena 3-amino-5-hidroksibenzojska kislina (AHBA), ki je na podlagi poliketidne poti tipa 1 podaljšana z dvema acetatnima in 8 propionatnimi enotami. Geni, ki omogočajo biosintezno pot rifamicinov so zbrani v rif predelu. Slednji zapisujejo za encime, ki sodelujejo pri sintezi AHBA kot tudi kot transaminaze in peptide sintetaze, ki omogočajo sintezo popolnega antibiotika. Rif predel vsebuje tudi številne potencialne regulatorne gene ter takšne, ki omogočajo številne post-translacijske spremembe.
Razvoj odpornosti
Največjo omejitev uporabe rifamicinov v zdravstvu predstavlja visoka raven razvoja odpornosti na njihovo delovanje, na podlagi česar so slednji uporabljeni izključno v kombinaciji z drugimi učinkovinami, najpogosteje z izoniazidom. Le-ti imajo v nasprotju z rifamicini učinke tudi na homeostazo človeških tkiv, na podlagi česar je uporaba takšnih antibiotikov omejena le na redke primere.
Velika večina mutacij, ki posledično pripeljejo do bakterijske rezistence na rifamicine, je posledica sprememb v rpoB genu, kodirajoč beta podenoto RNA polimeraze. Te so omejene na štiri manjše regije v genu, na podlagi česar se učinki antibiotika zmanjšajo do različne stopnje. Večina rezistentnih mutacij oslabi van der Waalsove interakcije ali povezavo z vodikovimi vezmi med rifamicini in RNA polimerazo, kar preprečuje dovolj močno interakcijo za popolno inhibicijo sinteze mRNA. Redkeje pa se z mutacijo spremeni struktura polimeraze do mere, ko antibiotik nanjo ni sposoben vezave.
Viri
Campbell, E.A., et.al. (2001). Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell, 104 (6): 901–12.
Feklistov, A., et.al (2008). Rifamycins do not function by allosteric modulation of binding of Mg2+ to the RNA polymerase active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105 (39): 14820–5.
Floss, H. G., & Yu, T.-W. (2005). Rifamycin – Mode of Action, Resistance, and Biosynthesis. Chemical Reviews, 105(2): 621-32.
Hartmann, G., Honikel, K. O., Knusel, F., & Nuesch, J. (1967). The specific inhibition of the DNA-directed RNA synthesis by rifamycin. Biochimica et Biophysica Acta, 145 (3): 843-844.
Sensi, P., Margalith, P., & Timbal, M. T. (1959). Rifomycin, a new antibiotic; preliminary report. II Farmaco; Edizione Scientifica, 14(2); 146-147.
