Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave
Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.
Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov. Ker njihovo delovanje temelji na encimski aktivnosti, so hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov, obenem pa je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni. Poleg tega terapevtsko uporabljeni endolizini delujejo na PG od zunaj, torej jim za delovanje ni potrebno dejansko vstopiti v celico. Čeprav je bila na začetku eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, ki nimajo zunanje membrane, pa so s pomočjo bioinženirskih izboljšav razširili delovanje nekaterih endolizinov tudi na Gramnegativne.
Delitev endolizinov
Struktura
Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani. S tem nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.
Katalitska zmožnost
Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.
N-acetilglikozidaze
N-acetilmuramidaze
N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.
Izboljšave
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.
