Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina
Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda Caudiovirales. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju viriona, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.
DNA pakirajoči motor bakteriofagov
Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni in portalni proteinski kompleks skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.
Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta pac (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (cos), tako da se celoten genom nahaja med dvema cos cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.
Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma
Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.
Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.
Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.
