RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

1. UVOD

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

2. OPIS PROJEKTA

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

2.1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

2.3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

3. ZAKLJUČEK

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== VIRI ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.