MIBOM - biokompatibilni material iz školjk

MIBOM je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2021 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Univerze ShanghaiTech na Kitajskem.

Spletna stran projekta MIBOM: https://2021.igem.org/Team:ShanghaiTech_China

Avtorica povzetka: Manca Osolin

Problem: kominutivni zlom

Kominutivni zlom je zlom kosti na več kot dva fragmenta in predstavlja najbolj resno poškodbo kosti. Do tovrstnih zlomov prihaja po poškodbah zaradi hudega trčenja, kot so prometne nesreče, nesreče pri športu in padci [1, 2].

95 % vseh zlomov stegnenice predstavljajo kominutivni zlomi. V primerjavi z enostavnimi zlomi trajajo operacije za kominutivne zlome v povprečju dvakrat dlje, ker je treba fragmente zdrobljenih kosti fiksirati s pomočjo kovinskega vsadka. Določenih majhnih fragmentov pa ni možno ustrezno fiksirati, zato je treba izvesti osteotomijo (umetna prekinitev kosti). Problem predstavlja tudi visoka cena operacije, dolg čas okrevanja in dodatna operacija za odstranitev kovinskega vsadka [2].

Školjke kot vir vodoodpornih bioadhezivov

Školjke vsebujejo bisus, posebno strukturo, s pomočjo katere se pritrjajo na podlago. Bisus je sestavljen iz snopa niti, na koncu katerih je adhezivni plak, ki vsebuje vodoodporne adhezivne proteine, ki školjkam omogočajo pritrjanje na različne podlage ter vzdržijo povečane mehanske obremenitve zaradi valov in tokov. Ker adhezivi, ki se jih trenutno uporablja v medicini, onemogočajo adhezijo v vodnem okolju, so adhezivni proteini školjk zanimivi za tovrstno uporabo [3, 4].

Ideja: projekt MIBOM

Ekipa iz Šanghaja si je zamislila osteogeno biokompatibilno lepilo MIBOM na osnovi adhezivnih proteinov školjk, ki bi med sabo zlepilo fragmente zdrobljenih kosti in tako pomagalo pri regeneraciji kosti po kominutivnem zlomu. Sestavljajo ga štirje sistemi, odgovorni za adhezijo, strukturno jakost, regulirano razgradnjo materiala med procesom rasti kosti in sprostitev zdravil. MIBOM torej služi kot pomoč pri fiksaciji fragmentov zdrobljenih kosti, njihov cilj pa je nadomestiti kovinske vsadke [2].

Adhezijski sistem

Proteini iz noge školjk (angl. mussel foot proteins - Mfp) imajo ključno vlogo pri pritrjanju školjk na različne podlage [5, 6, 7]. Za adhezijo teh proteinov so ključni DOPA ostanki, ki omogočajo vzpostavitev vodikovih vezi, π−π interakcij nalaganja baz in kompleksacijo kovinskih ionov med DOPA ostanki Mfp in hidrofilnimi skupinami na površini [3, 5, 7,8].

Znotraj družine Mfp proteinov ima Mfp5 največjo vsebnost kateholne aminokisline DOPA (∼26 molarnih %) in posledično najmočnejšo adhezijo [4,5,8]. Poleg tega je Mfp5 biokompatibilen (v telesu sproži minimalni imunski odziv) in biorazgradljiv [9]. Zato so se pri projektu MIBOM odločili za uporabo Mfp5 kot ključno komponento adhezijskega sistema. Ker pa z izolacijo Mfp5 iz školjk lahko dobimo zgolj 1 mg Mfp5 iz 10 000 školjk, so se odločili za pripravo rekombinantnega proteina [2].

Ker lahko ponovitve zaporedja Mfp5 zagotovijo močnejšo adhezijo, so razvili biokocko BBa_K3755003 (Mfp5-2 CDS), ki jo sestavljata dve zaporedni kodirajoči zaporedji za Mfp5 iz klapavice Mytilus galloprovincialis. V ekspresijski vektor pET28a so pod močen promotor T7 vstavili zapis za N-končno fuzijo Mfp5-2 s heksahistidinsko oznako in AKTK oznako (biokocka BBa_K3755009), ki poveča hitrost iniciacije translacije in tako poveča učinkovitost translacije Mfp5-2 [2, 10, 11].

Za šasijo so izbrali bakterije Escherichia coli BL21[DE3], ker je RNA-polimeraza faga T7 integrirana v genom. Izražanje Mfp5 so inducirali z 1 mM končno koncentracijo IPTG in celice 8-10 ur gojili na 37 °C pri 220 rpm. Protein so očistili s pomočjo nikljeve afinitetne kromatografije, ker pa se Mfp5-2 nahaja večinoma v inkluzijskih telescih, so med čiščenjem Mfp5 dodali denaturant gvanidinijev hidroklorid, s čimer so omogočili topnost proteina. Izkoristek je znašal 24 mg Mfp5/L bakterijske kulture. Nato pa so tirozinske ostanke Mfp5 modificirali v DOPA s pomočjo tirozinaze. Da bi okarakterizirali adhezivne lastnosti s tirozinazo modificiranega Mfp5-1 in Mfp5-2, so izvedli test viskoznosti in ugotovili, da ima Mfp5-2 za 16,11 % močnejšo adhezijo kot Mfp5-1 [2].

Hidrogel

Da bi zagotovili večjo kohezijo (tj. prečno povezovanje adhezivnega materiala) in večjo strukturno jakost, so razvili hidrogel kot drugi sistem MIBOM. Vpeljali so dva sistema prečnih povezovalcev - želatin metakrilat (GelMA) in alginat [2].

Želatin metakrilat fotopolimerizira ob obsevanju z UV-svetlobo. Za fotoiniciator so izbrali LAP, za katerega je značilna hitra iniciacija polimerizacije (lepilo se strdi v 2-8 s obsevanja z UV-svetlobo) in dolga ekscitacijska valovna dolžina (λ = 405 nm), ki minimalno poškoduje celice in tkiva, kar so preverili s testom fototoksičnosti [2].

Ker se GelMA v organizmu hitro razgradi in nima dovolj visoke strukturne jakosti so dodali še alginat, ki se prečno poveže ob vezavi Ca²⁺ ionov. Hidrogel se torej najprej delno strdi z obsevanjem z UV-svetlobo, kar zdravnikom omogoča, da postavijo fragmente kosti v ustrezen položaj, ob vezavi Ca²⁺ ionov pa se hidrogel popolnoma strdi. Dolgoročno viabilnost celic HUVEC v hidrogelu so testirali tako, da so jih enkapsulirali v hidrogel, jih gojili 21 dni in jih vsake tri dni barvali s fluorescein diacetatom (obarva žive celice) in propidijevim jodidom (obarva mrtve celice). Delež preživelih celic je znašal okoli 60 % [2].

Testirali so tudi adhezijo Mfp5 v kombinaciji z GelMA, ki se je povečala za 36,2 % v primerjavi z GelMA in za 260,8 % v primerjavi z Mfp5. Preverili so tudi reološke lastnosti hidrogela, s čimer so dokazali, da je njihov material primeren za regeneracijo kosti [2].

Regulacijski sistem

Čas razgradnje lepila se mora ujemati s procesom rasti kosti. Komponenti hidrogela, GelMA in alginat, sta biorazgradljiva materiala, vendar hitrosti njune razgradnje ne moremo nadzorovati. Zato se čas njune razgradnje pogosto ne ujema s časom rasti kosti, ta se namreč razlikuje med pacienti glede na nivo zloma in starost. Zato so razvili regulacijski sistem, občutljiv na mehanski pritisk, ki deluje na hidrogel zaradi rasti kosti, kar deluje kot signal za razgradnjo hidrogela. Kot mehanski senzor so uporabili Piezo1, ki zazna mehanski pritisk, kar povzroči vdor Ca²⁺ ionov v celice, ti pa sprožijo signalno pot, ki privede do izražanja alginat liaze, ki razgradi alginat [2].

Piezo1 je evkariontski mehansko občutljiv kalcijev kanalček. Da bi povečali mehansko občutljivost Piezo1, so razvili spojitveno varianto Piezo1.1, kjer je ekson 30 izrezan (biokocka BBa_K3755006). Načrtali so sestavljen biološki del (BBa_K3755016), ki ga sestavljajo CMV ojačevalec in promotor, zapis za mPiezo1.1 in mRuby2 (rdeči fluorescenčni protein z izboljšanimi fotofizikalnimi lastnostmi) ter bGH poliA signal [2].

Da bi preverili, ali po mehanski stimulaciji pride do vdora Ca²⁺ ionov v citoplazmo, so načrtali sestavljen biološki del GCaMP6m (BBa_K3755041) za zaznavanje vdora Ca²⁺ ionov. Sestavljen je iz cirkularno permutiranega GFP (cpGFP), kalmodulina (CaM) in kalmodulin-vezavnega peptida (CBP). Ob povečanju znotrajcelične koncentracije Ca²⁺ ionov se ti vežejo na CaM in ga aktivirajo, aktiviran CaM pa se veže na CBP, kar povzroči konformacijsko spremembo cpGFP, posledično pa se poveča intenziteta fluorescence pri 510 nm. Ta sestavljen biološki del so s pomočjo kloniranja po Gibsonu vnesli v vektor pEGFP pod nadzor CMV ojačevalca in promotorja, na 3' konec zapisa za GCaMP6m pa so dodali SV40 poliA signal [2].

Celice HEK293 so s pomočjo lipofektamina transfecirali z vektorjema pcDNA3.1-Piezo1.1-mRuby2 in pEGFP-GCaMP6m ter jih mehansko stimulirali na dva načina: z dodatkom nizkomolekularne spojine Yoda1 v gojišče in z izsesavanjem gojišča s pipeto (delovanje strižne sile). Pri tem se intenziteta zelene fluorescence poveča v nekaj sekundah, sprememba pa je hitrejša in očitnejša pri izsesavanju gojišča kot pri dodatku Yoda1. V kontrolni skupini so celice HEK293 transfecirali zgolj s pEGFP-GCaMP6m, jih stimulirali z Yoda1 in mehanskim stresom, pri čemer se fluorescenca ni spremenila. Tako so dokazali, da mehanska stimulacija preko Piezo1.1 kanalčkov sproži vdor Ca²⁺ ionov in posledično intenzivnejšo fluorescenco cpGFP [2].

Signalna pot, ki jo sprožijo Ca²⁺ ioni

Vezava Ca²⁺ ionov na kalmodulin ga aktivira, aktiviran kalmodulin pa aktivira kalcineurin, ki defosforilira jedrni faktor aktiviranih T-celic (NFAT), kar izpostavi jedrni lokalizacijski signal, zato pride do vnosa NFAT v jedro, kjer se veže na odzivni element za NFAT. Da bi preverili delovanje te signalne poti, so v vektor pGL4.30 klonirali zapis za odzivni element za NFAT (NFAT-RE), ki mu sledi minimalni promotor (Pmin) in zeleni fluorescenčni protein (eGFP), ki so ga uporabili namesto alginat liaze, da so lahko s pomočjo kolokalizacije dveh fluorescenčnih proteinov potrdili, da mehanski pritisk sproži to signalno pot [2].

24h po kotransfekciji celic s pGL4.30-eGFP in pcDNA3.1-Piezo1.1-mRuby2 so celice mehansko stimulirali z izsesavanjem gojišča oz. na stresalniku za 10 min pri 200 rpm. Kolokalizacija zelene in rdeče fluorescence dokazuje, da mehanski stres preko Piezo1.1 kanalčkov sproži to signalno pot, ki jo inducirajo Ca²⁺ ioni. Pri celicah v kontrolni skupini, ki jih niso mehansko stimulirali, namreč ni prišlo do zelene fluorescence eGFP [2].

Razvili so tudi biokocko za alginat liazo (BBa_K3755013) s človeškim signalnim zaporedjem IL-2 za izločanje alginat liaze iz sesalskih celic [2].

Sistem sproščanja zdravil

V hidrogel bi enkapsulirali zdravila, ki bi se lokalno sproščala ob razgradnji hidrogela. Razvili so model, ki simulira sproščanje zdravil in ga popravili s pomočjo rezultatov testa sprostitve zdravil, ki so ga naredili tako, da so v alginatni hidrogel enkapsulirali inzulin, ju potopili v DMEM gojišče in naslednjih pet dni merili koncentracijo inzulina v gojišču s pomočjo ELISA testa [2].

Zaključek

V okviru projekta MIBOM je ekipa iz Šanghaja razvila biokompatibilni material iz školjk, namenjen regeneraciji kosti po kominutivnem zlomu. Njihov produkt predstavlja alternativo kovinskim vsadkom in bi tako rešil problem zahtevne operacije, dolgega časa okrevanja in slabe regeneracije kosti po operaciji. S projektom so dosegli 3. mesto med dodiplomskimi projekti na tekmovanju iGEM 2021.

Viri

[1] Comminuted Fracture Definition | Spine health https://www.spine-health.com/glossary/comminuted-fracture (pridobljeno 19. 3. 2022)

[2] Team:ShanghaiTech China - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:ShanghaiTech_China (pridobljeno 19. 3. 2022)

[3] D. S. Hwang, H. J. Yoo, J. H. Jun, W. K. Moon in H. J. Cha: Expression of functional recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(6), str. 3352–3359.

[4] P. Kord Forooshani in B. P. Lee: Recent approaches in designing bioadhesive materials inspired by mussel adhesive protein. J. Polym. Sci. A Polym. Chem. 2017, 55(1), str. 9-33.

[5] E. W. Danner, Y. Kan, M. U. Hammer, J. N. Israelachvili in J. H. Waite: Adhesion of mussel foot protein Mefp-5 to mica: an underwater superglue. Biochemistry. 2012, 51(33), str. 6511-6518.

[6] B. P. Lee, P. B. Messersmith, J. N. Israelachvili in J. H. Waite: Mussel-inspired adhesives and coatings. Annu. Rev. Mater. Res. 2011, 41, str. 99-132.

[7] B. Yang, J. Song, Y. Jiang, M. Li, J. Wei, J. Qin, W. Peng, F. L. Lasaosa, Y. He, ... Z. Gu: Injectable adhesive self-healing multicross-linked double-network hydrogel facilitates full-thickness skin wound healing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2020, 12(52), str. 57782-57797.

[8] B. P. Lee, P. B. Messersmith, J. N. Israelachvili in J. H. Waite: Mussel-inspired adhesives and coatings. Annu. Rev. Mater. Res. 2011, 41, str. 99-132.

[9] J. Huang, H. Li in Q. Wang: Development of double-component rapid curing bioadhesive. 2018, 35(6), str. 921-927.

[10] E. Kim, B. Dai, J. B. Qiao, W. Li, J. D. Fortner in F. Zhang: Microbially synthesized repeats of mussel foot protein display enhanced underwater adhesion. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2018, 10(49), str. 43003-43012.

[11] T. Tuller, A. Carmi, K. Vestsigian, S. Navon, Y. Dorfan, J. Zaborske, T. Pan, O. Dahan, I. Furman in Y. Pilpel: An evolutionarily conserved mechanism for controlling the efficiency of protein translation. Cell. 2010, 141(2), str. 344-54.