Razporejanje plazmidov v hčerinski celici

Uvod

Plazmidi živijo s svojo gostiteljsko celico v simbiozi. Razvili so kar nekaj strategij za obstoj znotraj bakterijske populacije med katerimi je razporeditveni sistem. Vsi razporeditveni sistemi so sestavljeni iz treh delov: ene ali več kopij razporeditvenega mesta (centromer), CBP (centromerni vezavni protein) in NTP-aze.

Izračun izgube plazmida

Plazmidi z majhnim kopirnim številom se morajo za svoj obstoj nanašati na razporeditveni sistem, plazmidi z visokim številom kopij pa se zanašajo na pasivno difuzijo. Za naključno distribucijo velja: Ploss = 2^(1-n), kjer je »n« število kopij v celici.

Sistemi in kompleksi razporejanja plazmidov

Razporeditveni sistemi so nujni za transport in vzpostavitev sistema s plazmidno DNA. Poznamo 3 razporeditvene sisteme, ki se razlikujejo po tipu razporejanja z NTP-azo. Centromeri so značilna ohranjena zaporedja na plazmidu, ki služijo kot prepoznavna mesta za CBP. CBP prepozna zaporedje na plazmidu in se tako veže na centromer. To deluje kot most med plazmidom in ustrezno NTP-azo, ki omogoča premik plazmida.

Tip I ima Walker ATP-azo, ki ločuje plazmid s formacijo dinamičnega vzorca na bakterijskem nukleoidu. Tip II uporablja aktinu podobno ATP-azo, ki polimerizira v dinamične filamente, ki potiskajo plazmida narazen. Tip III ima tubulinu podobne GTP-aze, ki prav tako delujejo preko dinamične polimerizacije mehanizma. Različni tipi so prikazani na sliki 1.

Arhitektura

CBP-ji se lahko na prepoznavno mesto vežejo v več kopijah in tako tvorijo razporeditvene komplekse, katerih arhitektura je odvisna od tipa CBP. CBP tip I vsebuje motiv HTH2 in prepozna centromerno mesto parS, kamor se veže v več kopijah in gradi velike komplekse. To omogoča številne interakcije z ustrezno NTP-azo. CBP tip II (vsebuje RHH2 motiv) in tip III (vsebuje HTH2 motiv) tvorita podobne komplekse in sicer, oba tvorita vijačne, obročaste strukture in povzročita upogib DNA.

Vizualizacija plazmidnih dinamik v celici

Tip I

Najraje se nahajajo na četrtini ali polovici celice v majhnih in večjih celicah. V vseh primerih pa vpadajo z bakterijskimi nukleoidom. ParB in RHH2 so prisotni v velikih količinah znotraj celice in so kot žarišča, ki so odvisni od razporeditvenega mesta in korespondirajo na pozicijo plazmida. ParB iz F plazmidov so prisotni v skupkih v okolici F razporeditvenega mesta, parSF. Razporeditveni kompleksi plazmida F so najdeni znotraj večje mase nukleoida. ParA imajo oscilatorno vedenje, nekatere pa tvorijo dinamične gradiente.

Tip II in III

ParMR1 tvorijo dolge filamente. Plazmidi niso prisotni na obeh koncih ParM polimerov. Premik plazmidne DNA na nasproten pol celice žene ParM polimerizacija med sestrskima ParR-parC (R1 centromer) kompleksoma.

Tubulinu podobna GTP-aza iz Gram-pozitivnih bakterij tvori dinamične in citoskeletne filamente, kar nakazuje, da tip III deluje po filamentacijskem mehanizmu za razporejanje plazmidov znotraj celic.

Slikovna obdelava razporeditve in ločitve plazmidov z velikim številom kopij Plazmidi naj bi sledili obliki ameriškega krofa. Prosto difundirajoči plazmidi so večinoma izven nukleoida v notranjem periferiju bakterije. Plazmidi z visokim kopirnim številom so v skupkih na polih celice in naključno razporejeni skozi celoten volumen celice z nižjo frekvenco znotraj nukleoida. To podpira model mešane distribucije, ki vključuje možnost nastajanja skupkov in naključno difuzijo individualnih plazmidov z visokim številom kopij.

Mehanizmi razporeditve plazmidov

Gonilo za razporeditev plazmidov predstavljajo ATP-aze in GTP-aze, ki zagotavljajo energijo za ustrezen premik plazmidov. Obstajata dva glavna razreda mehanizmov razporeditve plazmidov.

Mehanizmi, ki vključujejo filamentacijo

Po tem mehanizmu delujeta razporeditvena sistema tipa II in III.

Razporeditveni sistem tipa II

Razporeditvene ATP-aze tipa II (ParM) spadajo v razred aktinu podobnih proteinov. Te so sposobne polimerizacije in oblikovanja filamentov, ki potiskajo plazmida, pripeta na nasprotna konca filamenta, narazen (pri paličičastih bakterijah je to vzporedno z longitudinalno osjo celice).

Monomeri ParM polimerizirajo v prisotnosti ATP, pri čemer tvorijo levosučne dvojne vijačnice, ki so polarne (polarnost je posledica asimetrije monomerov, zato vsak filament vsebuje top in oster konec. ParR (CBP), ki je vezan na parC plazmida, se veže na topi konec filamenta in ustvari kapo, ki prepreči razgradnjo filamenta kljub hidrolizi ATP. Novi ParM-ATP monomeri se nato vstavljajo na topi konec skozi konkavni stik med ParR/parC. Ko filament raste, potiska plazmid na topem koncu in plazmid se premika po celici. Filamenti se urejajo v antiparalelne snope, kar pomeni, da so topi konci (mesta, kamor se veže plazmid) na obeh straneh snopa. Ko filamenti v snopu rastejo potiskajo plazmide, vezane na tope konce, na nasprotna pola celice. Slika 2 (A in B)

Razporeditveni sistem tipa III

Razporeditveni sistem tipa III prav tako deluje na principu polimerizacije, ampak pri tem kot gonilno moč uporablja tubulinu podobne GTPaze (TubZ). Monomeri TubZ polimerizirajo v prisotnosti GTP in tvorijo dvo- in štirivijačne filamente, ki so stabilizirani z GTP kapo. TubZ filamenti so polarni, kar pomeni, da rastejo na + koncu in se razgrajajo na – koncu. Tja se veže tudi TubR (CBP), vezan na tubC. Ko polimer raste na + strani in se razgrajuje na – strani, mu razporeditveni kompleks sledi, kar se kaže v premikanju plazmida. Kako pa ta vleka plazmidov prispeva k ločitvi plazmidov še ni pojasnjeno, saj TubZ filamenti niso bipolarni (premikanje poteka le v eno smer). Slika 2 (C)

Mehanizem po principu Brownovega zobatega kolesa

Razporeditveni sistem tipa I, ki je pri bakterijah najbolj pogost, za razliko od drugih dveh tipov pa ne deluje na principu polimerizacije. Pri njegovem mehanizmu sodelujejo ATP-aze tipa Walker (ParA). Te so sposobne interakcije z bakterijskim nukleoidom in v celici tvorijo dinamičen gradient. Interagirajo tudi s proteini ParB (CBP), ki nosijo plazmidni tovor in sledijo gradientu ParA. Predpostavljenih je bilo več modelov kako ParB sledijo gradientu ParA, vsi pa delujejo na osnovi principa Brownovega zobatega kolesa.

V prisotnosti ATP se ParA veže na DNA (ATP pri tem hidrolizira). V naslednjem koraku se na ParA veže ParB, ki je vezan na parS (nosi plazmid) in pri tem iz nukleoida izrine ParA. Ta oddifundia v citoplazmo, kjer čaka, da se nanj ponovno veže ATP. Ker pa je ta korak zelo počasen, začne na nukleoidu primanjkovati ParA. ParB se torej premika po nukleoidu in za seboj pušča ParA praznino – gibanje plazmida je zato usmerjano stran od nižje koncentracije ParA. Plazmida bi se po replikaciji tako ločila, če bi bila koncentracija ParA med njima najnižja. Obstaja več različnih modelov mehanizma Brownovega zobatega kolesa, vsi temeljijo na asimetriji distribucije ParA na bakterijskem nukleoidu. Delovanje lahko povežemo s konceptom požganega mostu – ko se ParB s plazmidnim tovorom premakne po nukleoidu, na svoji poti iz nukleoida odstranjuje ParA in s tem 'požge most za seboj', saj se zaradi odsotnosti Par A ne more vrniti nazaj. Predlagane verzije se med seboj razlikujejo po tem, kako asimetrija razporeditve ParA ustvari energijo, potrebno za gibanje in v vlogi, ki je pripisana bakterijskemu kromosomu in ParA oligomerizaciji.

Vse ATPaze tipa I uporabljajo mehanizem Brownovega zobatega kolesa, vendar pa je relevanten model najverjetneje odvisen od različnih biokemijskih značilnosti in ravni ekspresije ParA in ParB. Slika 3

Nezdružljivost plazmidov kot posledica razporejanja v celici

Dva različna plazmida, ki ne moreta stabilno obstajati v isti celici, sta nezdružljiva. Pri delitvah celice tako pride do izgube oziroma zmanjšanja števila vsaj enega od plazmidov, kar je posledica skupnih lastnosti nezdružljivih plazmidov. Do nezdružljivosti zaradi sorodnega načina razporejanja v celici pride tako pri razporejanju tipa 1 kot 2.

Nezdružljivost pri ParA

Če imamo v celici plazmid z visokim številom kopij in Par sistemom razporejanja, bo to onemogočilo stabilen soobstoj plazmida z enakim parA genom. Pretirano izražanje ParA, ki je prisoten v večih kopijah namreč povzroči, da se začneta plazmida ob delitvi naključno razporejati v hčerinske celice. Delež nezdružljivosti sovpada s koncentracijo ParA. Povečana koncentracija ParA destabilizira razporeditveni kompleks in mehanizem Brownovega zobatega kolesa, ki omogoča premikanje plazmidov po celici. Pri visoki koncentraciji ParA se praznine brez Par A lahko hitreje zapolnijo in tako onemogočijo gibanje plazmida po nukleoidu.

Nezdružljivost pri ParB

Analogno kot pri ParA dva plazmida, ki se razporejata s ParB, v isti celici nista stabilna, še posebej, če je eden od njiju plazmid z visokim številom kopij, saj je nezdružljivost odvisna od izražanja ParB. Previsoka koncentracija ParB najverjetneje povzroči koncentriranje plazmidov s parS genom v skupke in s tem zmanjša število plazmidov, ki se prosto gibljejo po celici. V tem primeru ParA ne more dovolj uspešno razdreti razporeditvenih kompleksov in sprostiti plazmidov, zato sčasoma pride do izgube enega od plazmidov. Hkrati so ugotovili, da lahko nekatere različice proteina, kot je ParBF, sprožijo rekombinacijo sorodnih plazmidov in tako povzročijo multimerizacijo. Multimer je plazmid, ki nastane s homologno rekombinacijo in vsebuje dve ponovitvi celotnega plazmidnega nukleotidnega zaporedja.

Nezdružljivost pri enakih centromerih

Če plazmida vsebujeta sorodno mesto za razporejanje, načeloma pride do nezdružljivosti. Vzrok ni povsem znan. Pri plazmidih z visokim številom kopij pride do naključnega razporejanja plazmidov, pri plazmidih, ki vsebujejo več parS mest pa tudi do zmanjšanega števila prostih ParB zaradi pretirane vezave na parS. Pri plazmidih z nizkim številom kopij opazimo zelo močno nezdružljivost, kjer je izguba števila plazmidov višja kot pri naključnem razporejanju. Eden od možnih vzrokov za to je pozna replikacija plazmidov. Če se eden od plazmidov podvoji ravno pred celično delitvijo, se kopiji namreč ne prerazporedita znotraj celice, ampak se obe dedujeta v isti hčerinski celici, kar privede do visoke izgube plazmidov.

Regulacija izražanja par gena

Izražanje par operonov direktno vpliva na stabilnost plazmidov in je v vseh primerih nadzorovano po principu avtoregulacije. Eden od proteinov par operona deluje kot represor, pogosto pa tudi eden od preostalih kot korepresor. V razporeditvenem sistemu tipa I so represorji ParA ATPaze, pri vseh ostalih sistemih pa proteini CBP. ParA represorji se z N-končnim delom s HTH (vijačnica-zavoj-vijačnica) motivom vežejo na DNA. Vezavno mesto ni povsem raziskano, vsebuje pa daljše obratne ponovitve, ki omogočijo vezavo ParA. Ta specifična vezava je mogoča ob vezavi ADP kot kofaktorja, pri vezavi ATP pa prevlada nespecifična vezava DNA, ki omogoči razporejanje plazmidov s pomočjo ParB.

Zaključek

Sistemi za razporejanje plazmidov so nujni za njihov obstoj in so kljub svoji preprostosti zelo natančno regulirani. Z dvema ključnima proteinoma in specifičnimi DNA zaporedji lahko predvsem plazmidi z manjšim številom kopij poskrbijo, da se ob delitvi uspešno dedujejo v obe hčerinski celici. Kljub široki uporabi plazmidnih vektorjev mnogi procesi, povezani z njihovim razporejanjem, še niso v celoti pojasnjeni. Raziskave v tej smeri bodo pripomogle k našemu razumevanju strukturne biologije in dinamike celotnega bakterijskega genoma.

Viri

Bouet, J.-Y.; Funnell, B. E. Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae. EcoSal Plus 2019, 8 (2), 10.1128/ecosalplus.ESP-0003–2019. https://doi.org/10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.

Schumacher, M. A. Bacterial Plasmid Partition Machinery: A Minimalist Approach to Survival. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, 22 (1), 72–79. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.11.001.

Gerdes, K.; Møller-Jensen, J.; Jensen, R. B. Plasmid and Chromosome Partitioning: Surprises from Phylogeny. Mol. Microbiol. 2000, 37 (3), 455–466. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01975.x.

Baxter, J. C.; Funnell, B. E. Plasmid Partition Mechanisms. Microbiol. Spectr. 2014, 2 (6), 10.1128/microbiolspec.plas-0023–2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0023-2014.

Brooks, A. C.; Hwang, L. C. Reconstitutions of Plasmid Partition Systems and Their Mechanisms. Plasmid 2017, 91, 37–41. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2017.03.004.