Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij

Uvod

Raziskovanje bakterij rodu Agrobacterium, zlasti na začetku, predstavlja pomembno poglavje na področju rastlinske patologije in biotehnologije. Pot se je začela z opazovanjem in raziskovanjem razvoja bakterijskega raka na rastlinah (crown gall disease), za katere so značilne tumorske rasti na dvokaličnicah – pojav, ki ga pripisujejo bakteriji Agrobacterium tumefaciens, etiološkemu agensu. Te rakave tvorbe se običajno pojavijo na koreninah, kjer so rane vstopne točke za bakterijo, da okuži in se pritrdi na kompetentne rastlinske celice, ki se delijo. Med nenormalnim razmnoževanjem celic bakterijskega in človeškega raka so opazili podobnosti, ki so vzbudile dodatno radovednost o morebitnih povezavah.

V prvih desetletjih 20. stoletja so bile raziskave osredotočene ne le na razumevanje vloge agrobakterij kot fitopatogena, temveč tudi na raziskovanje zanimive možnosti, da bi se načelo povzročanja tumorjev TIP (tumor-inducing principle) preneslo iz bakterije na rastlinske celice. Ena od ključnih ugotovitev je bila, da imajo celice bakterijskega raka edinstvene lastnosti, med drugimi sposobnost rasti v tkivni kulturi brez dodatka rastlinskih regulatorjev rasti – lastnost, ki je pri običajnih rastlinskih celicah ni. Ta pojav je nakazoval prisotnost prenosljivega dejavnika, odgovornega za povzročanje tumorske rasti, ki je bil pozneje opredeljen kot T-DNA.

V šestdesetih letih prejšnjega stoletja je prišlo do preboja z odkritjem opinov - nenavadnih metabolitov, ki jih najdemo izključno v rakavih rastlinskih celicah. Različni sevi agrobakterij so v tumorjih povzročili nastajanje določenih opinov, ki so jih bakterije lahko nato katabolizirale za lastno rast. Kljub težavam pri odkrivanju bakterijske DNA v celicah rakavih tvorb z obstoječimi metodami je identifikacija nenavadno velikih krožnih molekul DNA v virulentnih sevih bakterije Agrobacterium raziskovalcem utrla pot do prelomnega odkritja povzročitelja tumorja – Ti (tumor-inducing) plazmid.

Odkritje plazmida Ti je predstavljalo pomemben mejnik, saj je bil to prvi identificirani genetski element, ki prispeva k tumorogenosti. Ta ugotovitev je raziskovalcem omogočila, da so dobili poseben cilj za odkrivanje in nadaljnje raziskovanje, saj so le-te razjasnile molekularne mehanizme, na katerih temelji prenos T-DNA in omogočile razvoj sistema binarnih vektorjev – ključnega orodja za transformacijo rastlin, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji.

Razvoj v biotehnologiji

Čeprav je sprva veljalo, da imajo agrobakterije omejeno gostiteljsko območje le na dvokaličnice, so poznejše študije to domnevo ovrgle, saj so okužene enokaličnice vsebovale T-DNA, vendar se zaradi drugačnega odziva celic rakasta tvorba ni izrazila. Raziskave so torej pokazale prenos T-DNA tudi na enokaličnice, kar je razširilo področje uporabe genskega inženiringa s posredovanjem agrobakterij. Uporaba postopkov tkivnih kultur je omogočila regeneracijo transformiranih celic v transgenih rastlinah (med drugimi živilsko zelo pomembnega riža in koruze), s čimer se je uporabnost agrobakterij kot genskega vektorja v kmetijstvu še razširila. Prisotnost T-DNA so potrdili tudi pri prosto rastočih rastlinah v naravi, tako da bi lahko trdili, da uživamo transgene rastline dejansko že veliko stoletij.

Poleg uporabnosti v biotehnologiji so bile raznolikosti agrobakterij in njene interakcije z različnimi gostitelji predmet obsežnih raziskav. Identifikacija različnih plazmidov in kromosomskih ozadij znotraj sevov Agrobacterium je razkrila vpogled v njihove evolucijske odnose in prilagoditvene strategije. Analiza genoma je razkrila edinstvene značilnosti med biotipi in vrstami ter omogočila globlje razumevanje njihove genetske sestave in funkcionalne raznolikosti. Poleg Ti plazmida je v določenih vrstah bakterij Agrobacterium prisoten tudi plazmid Ri (root-inducing), ki povzroči bolezen dlakavih korenin (hairy-root disease). V isti družini bakterij ima rod Rhizobium prisoten tudi Sym (symbiosis) plazmid, ki pa je odgovoren za fiksacijo dušika. Kljub temu pa lahko prisotnost plazmida v določenih vrstah ne povzroči fiksacije dušika, čeprav nastanejo na koreninah noduli.

Poleg tega je raziskovanje kromosomskih genov virulence, kot so chvA, chvB in acvB, razširilo znanje o sposobnostih bakterij Agrobacterium, da prenašajo T-DNA. Ti geni imajo ključno vlogo pri interakcijah med rastlinami in patogeni ter so pomembni za biotehnološko uporabo.

Klasifikacija

Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.

Karakteristične regije Ti plazmidov

Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.

Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah

Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.

Mehanizem prenosa DNA

Senzorno-signalni regulatorni sistem proteinov virA in virG

Pri prenosu T-DNA iz Ti plazmida agrobakterij v gostiteljsko rastlinsko celico odigrajo pomembno vlogo virulentni geni (vir geni) Ti plazmida. Vsak od teh genov kodira za protein, ki ima specifično vlogo pri prenosu DNA. Izražanje večine teh genov se začne šele, ko pride agrobakterija v stik z rastlinsko celico oziroma ko pride v stik z izcedki, ki jih rastlina proizvajaob poškodbi. Tukaj so pomembni predvsem fenolni produkti in njihov nizek pH (med 5 in 6) med katerimi je najpomembnejši acetosiringon. To molekulo prepozna kinaza virA, ki se avtofosforilira, nato pa fosforilira še protein virG. VirG postane tako aktiven in zato lahko aktivira transkripcijo ostalih vir genov z vezavo na promotorsko regijo vsakega vir gena posebej, kar je med 50 in 200 bp pred začetkom transkripcije.

Nastanek enoverižne T-DNA (ssT-DNA) in sekrecijskega sistema tipa 4 (T4SS)

Znanstveniki so ugotovili, da je mehanizem prenosa T-DNA zelo podoben bakterijski konjugaciji. Relaksaza virD2 s pomočjo topoizomeraze virD1 naredi zarezo na robnem zaporedju, ki je ekvivalenten mestu oriT pri konjugaciji. Ker virD2 prepozna le robno zaporedje je vseeno kaj vsebuje regija T-DNA, kar izkoriščajo v biotehnologiji za vnašanje željenih genov v rastlinski genom. Zaradi zareze se sproži popravljanje DNA od zareze naprej, kar sprosti linearno ssT-DNA, ki ima na 5' koncu kovalentno vezan virD2, kar se skupaj imenuje T kompleks. Pri prenosu ssT-DNA in nekaterih vir proteinov iz agrobakterije v rastlinsko celico sodeluje 11 virB proteinov in virD4 protein, ki skupaj tvorijo sekrecijski sistem tipa 4. T4SS je sestavljen iz membranskega kanalčka in pilusa. Večina virB proteinov tvori membranski kanalček, nekaj pa jih tvori tudi pilus. Za njegovo izgradnjo je najpomembnejši pilinski protein virB2. Protein virD4 prepoznava in prepušča le določene molekule, ki želijo vstopiti v T4SS.

Prenos v rastlinsko celico

Še vedno se ne ve točno kako se preko T4SS prenesejo ssT-DNA in ostali proteini v citoplazmo rastlinske celice. Eden od možnih načinov je približanje celic z depolimerizacijo virB2 pilusa in končnim zlitjem membran obeh celic, ki bi omogočil prenos molekul. Drugi možen način je prenos molekul preko pilusa, ki interagira z molekulami membrane gostiteljske celice ter tako ustvari poro v njej preko katere bi molekule lahko vstopile v citoplazmo. Zaenkrat pa še ni bilo identificirane nobene take interakcije med agrobakterijo in rastlinsko celico, poleg tega pa je do prenosa ssT-DNA prišlo tudi v mutiranih agrobakterijah na genu za virB2, ki so bile nezmožne tvoriti pilus. Še en možen način za prenos bi bil prenos molekul najprej v zunajcelični prostor in nato vstop v rastlinsko celico preko endocitoze. K temu načinu pripomore tudi dejstvo, da protein virE2 interagira z zgodnjimi endosomi v gostiteljski celici, prav tako pa so inhibitorji endocitoze poslabšali prenos tega proteina kot tudi končno transformacijo.

Prenos v rastlinsko jedro

Pri prenosu T kompleksa v jedro rastlinske celice sodelujejo še nekateri drugi vir proteini. Pomemben je protein virE2, kar kaže tudi skoraj popolna izguba kancerogenosti agrobakterije v primeru mutacije na genu za ta protein. VirE2 je protein ki se veže na T kompleks in ga obda, kot na primer kapsid pri virusih. Tako ga zaščiti pred delovanjem nukleaz, enoverižnim prileganjem in zvitjem, kar bi onemogočalo vstop v jedro. Tako virD2 in virE2, ki sta vezana na ssT-DNA imata tudi pomembno funkcijo pri prenosu v jedro. Del C-končne domene virD2 je tudi NLS, ki ga prepozna α-importin in tako kompleks usmeri proti jedrnim poram, virE2 pa kompleksu pomaga pri premikanju skozi citoplazmo in jedrno poro. Ko pride ssT-DNA v jedro se pretvori v dvoverižno DNA (T-DNA). T-DNA se nato vstavi tam kjer je rastlinski DNA pretrgan. Proces poteka po principu povezovanja nehomolognih koncev, s pomočjo rastlinskih proteinov, ki so za to potrebni. Obstaja tudi alternativni način vstavitve T-DNA in sicer povezovanje koncev s pomočjo DNA polimeraze teta.

Plazmid Ti v praktični uporabi

AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH. AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije. Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.

Viri

Hooykaas, P.J.J. The Ti Plasmid, Driver of Agrobacterium Pathogenesis. Phytopathology 2023 113 (4). https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-22-0432-IA

Rahman, S.U., Khan, M.O., Ullah, R. et al. Agrobacterium-Mediated Transformation for the Development of Transgenic Crops; Present and Future Prospects. Molecular Biotechnology 2023. https://doi.org/10.1007/s12033-023-00826-8

Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. [cited 3 May 2024]. doi:10.1128/mmbr.67.1.16-37.2003

Lacroix B, Citovsky V. Pathways of DNA Transfer to Plants from Agrobacterium tumefaciens and Related Bacterial Species. Annual Review of Phytopathology. 2019;57: 231–251. doi:10.1146/annurev-phyto-082718-100101