FluoroLoop

Seminar na osnovi iGEM project [1]

Uvod

Problematika PFAS

Per- in polifluorinirane alkil snovi, ki jih poznamo pod kratico PFAS, so pestra skupina sintetičnih kemikalij, ki se uporabljajo za proizvodnjo produktov s fluoropolimernimi premazi približno od leta 1950 - od posode proti prijemanju, dežnih plaščev do ognjevarnih pen. So dolgotrajni okoljski onesnaževalci, ki lahko povzročajo izgubo biodiverzitete, rakava obolenja in neplodnost. Gre za skupino ti. »večnih kemikalij« oziroma forever chemicals, ki so močno ali popolnoma fluorirane. Zaradi vezi C-F so zelo stabilne, kar je v določenih primerih izredno uporabna lastnost, a obenem predstavlja veliko breme za okolje – same od sebe namreč ne razpadejo, za razgradnjo večinoma potrebujejo temperature višje od 1100 ^oC, mikroorganizmi jih načeloma ne morejo razgraditi. Znani so tudi kot bioakumulanti in imajo za človeka številne negativne posledice [1-3].

Določanje PFAS

Zaenkrat se za določanje PFAS v vzorcih odpadne vode uporabljajo:

• • kromatografske metode:

­***LC-MS (tekočinska kromatografija in masna spektrometrija)

• • • GC-MS
  • semi-kvantitativne metode:
    • TOP (total oxidizable precursor)
    • TOF (total organic fluorine)
  • terenske metode:
    • kolori/fluorimetrične
    • elektorkemični senzorji

Najpogosteje se za določanje PFAS uporabljajo kromatografske metode, predvsem LC-MS. Slednja ima sicer nizek nivo detekcije (1 ng/L) za mnoge PFAS, a je draga in zaradi potovanja vzorca do laboratorija lahko traja dlje. Tako se pojavlja potreba po načinu določanja PFAS, ki je hitro, zanesljivo in učinkovito [3,4].

Inovativna ideja FluoroLoop

Ideja projekta FluoroLoop je izgradnja biosenzorja na osnovi aptamerov, ki bi omogočal hitro in zanesljivo testiranje PFAS v vodi. Biosenzor je osnovan na tRNA-posnemajočih strukturah (TMS) z aptamerom, specifičnim za perfluorooktanojsko kislino (PFOA). TMS so regulatorji izražanja proteinov – ti. RNA-stikala, ki bi jih lahko uporabljali tudi za zaznavo drugih problematičnih okoljskih onesnaževalcev. Prednost TMS pred drugimi podobnimi regulatorji je v njihovi raznolikosti in modularnosti – omogočajo pester nabor sprememb ter tako prilagodljivost na nabor različnih vhodnih signalov (RNA, majhne molekule, proteini)[3].

TMS (tRNA-mimicking structures)

TMS oziroma tRNA-posnemajoče strukture (Slika 1) predstavljajo novo možnost regulacije izražanja proteinov – temeljijo na metazojski mitohondrijski tRNA in v strukturi vsebujejo tri module (za projekt sta pomembni predvsem zanka D in represorska domena). V principu delujejo tako, da se vežejo na začetek in konec zaporedja RBS na mRNA, s čimer onemogočijo vezavo ribosoma in s tem translacijo. Z dodatkom aptamernih zaporedij v zanko D vezavo TMS na mRNA povežemo s prisotnostjo določenega liganda, kar je tudi osnovna ideja projekta. Zanka D je namreč pomembna za ustrezno 3D strukturo molekule – ob vezavi liganda se ta struktura poruši in TMS ni več sposobna vezave na mRNA, kar omogoči izražanje proteina. Sistem tako omogoča zlahka prilagodljivo potencialno biokocko, ki lahko detektira vsako molekulo, za katero obstaja aptamer [3,5]. Slika 1: Delovanje TMS. Glede na specifičnost aptamera lahko odzivnost TMS vežemo na prisotnost določenega liganda. Represija je v tem primeru odvisna tudi od koncentracije liganda [3,5].

Izvedba projekta FluoroLoop

Projekt so začeli z validacijo TMS, kjer so – poleg začetnih eksperimentov – testirali nekatere že poznane aptamere – specifično dve verziji manganovega aptamera in dve verziji teofilinskega aptamera, s čimer so preverjali odvisnost delovanja TMS od liganda. Predhodno odkrite, PFOA specifične aptamere so poskušali optimizirati ter karakterizirati, a pri delu niso bili uspešni. Za namen projekta so tako uporabili aptamer iz referenčnega članka [6]. Optimizirali so njegovo dolžino ter ohranili zgolj nujni del za vstavitev v zanko D izbrane TMS – osrednji del pripravljenega biosenzorja. Poleg in vitro validacije, si je ekipa zadala tudi oblikovanje bioinformatskega orodja, ki bi omogočalo načrtovanje in optimizacijo aptamerov s povezovanjem različnih orodij za molekulsko modeliranje [3].

Validacija regulacijskega sistema TMS

Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (Uracil Specific Excision Reagent). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo podaljše z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev – slednji so lahko oblikovani različno, kar omogoča kreacijo različnih komplementarnih previsov. Skupina je pridobljene produkte klonirala v DH5alfa E. coli. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v E. coli BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ugotvaljali uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7]. Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3]. Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.

Opravili so dva sklopa eksperimentov.

Izražanje mCherry v odvisnosti od GFP

Sistem potrebuje tri komponente, od katerih je vsaka inducibilno regulirana – izražanje GFP, ki bo deloval kot ligand za TMS, ki bi se sicer vezala na mRNA zapis za protein mCherry (Slika 2). Brez izražanja GFP bi TMS zavrla izražanje mCherry – ne bi opazili fluorescence. Ob izražanju GFP se bi ta povezal s TMS, spremenil njegovo strukturo in onemogočil vezavo na transkript mRNA. Opaziti bi morali fluorescenco, kar so uspešno potrdili tudi rezultati skupine [3]. {File:TMS1.png|Slika 2: Predstavitev sistema plazmidov za izražanje vseh treh komponent - GFP, mCherry in TMS. GFP je induciran z anhidrotetraciklinom, mCherry z L-arabinozo in TMS z IPTG [3].]]

Literatura

[1] M. Frey, U. Bathe, L. Meink, G. U. Balcke, J. Schmidt, A. Frolov, A. Soboleva, A. Hassanin, M. D. Davari, O. Frank, idr.: Combinatorial biosynthesis in yeast leads to over 200 diterpenoids. Metab Eng 2024, 82, 193–200.
[2] S. Perveen, S. Perveen: Introductory Chapter: Terpenes and Terpenoids. Terpenes and Terpenoids 2018.
[3] J. Andersen-Ranberg, K. T. Kongstad, M. T. Nielsen, N. B. Jensen, I. Pateraki, S. S. Bach, B. Hamberger, P. Zerbe, D. Staerk, J. Bohlmann, idr.: Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition 2016, 55, 2142–2146.