Mehanizem modifikacije histonov

1.UVOD

Histoni so proteini ki, ko se povežejo z DNA tvorijo kromosom. DNA pa je v celicah večinoma v obliki kromatina, katerega pomemben gradbeni element je tako imenovani nukleosom. Le ta je sestavljen iz oktamera histonov (H2A, H2B, H3, H4). Pri epigenetskih modifikacijah, reverzibilne post-translacijske modifikacije histonov, predstavlja predvsem acetilacija aminokislin v histonskih repih. Lahko pa poteka tudi metilacija (lizina, arginna; mono ali -di -tri), fosforilacija (serina), ubikvitinacija (lizina), glikozilacija (asparagina, treonina in serina), ubikvitinacija (lizina), sumoilacija (lizina), poly ADP-ribozilacija, biotinilacija (lizina), karbonilacija.

---

1.1 FOSFORILACIJA

Fosforilacija poteka predvsem na serinskem ostanku histonov: H2A, H2B, H3 in H4. Dodatek negativno nabitih skupin nevtralizira njihov osnovni naboj. Posledično se zmanjša afiniteta do DNA. Fosforilacija serina 10 na H3 poveča aktivnost HAT. To nakazuje, da fosforilacija vpliva na izražanje genov posredno, preko stimuliranja aktivacije drugih post-translacijskih modifikacij.

---

1.2 GLIKOZILACIJA

Pri glikozilaciji se dodajajo oligosaharidne komponente preko amidne skupine asparagina (N-glikozilacija) ali preko hidroksilne skupine serina ali treonina (O-glikozilacija) na proteine. N-glikozilacija lahko poteče le, če je zaporedje Asn-X-Ser/Thr (X ne sme biti prolin). Poteče na vseh vrstah histonov (H1, H2A, H2B, H3 in H4). Glikozilacijo histonov z O-GlcNac katalizira encim O-GlcNac transferaza.

---

1.3 UBIKVITINACIJA

Ubikvitinacija poteka na histonih H2A (15%), H2B (2%), H1 in H3. Pri vseh ubikvitinacijah histonov gre večinoma za monoubikvitinacijo. Najbolj verjetni mehanizem je, da ubikvitin vpliva na transkripcijo tako, da vpliva na druge proteine, ki modificirajo histone. Pri dodajanju ubikvitina na histon sodelujejo encimi E1, E2, E3. Njegovo odstranjevanje pa katalizirajo encimi izopeptidaze.

---

1.4 SUMOILACIJA

Sumoilacija histonov regulira represijo transkripcije. Poteka na lizinskih ostankih histonov H2A, H2B, H3 in H4. Sumoilacija slednjega je najpogostejša. Sumo-H4 vpliva na aktivnost histon deacetilaz 1(HDAC1) in HP1. Predstavlja signal za prehod od aktivacije do represije kromatina. SUMO verjetno blokira vezavno mesto na lizinu, in s tem preprečuje acetilacijo in ubikvitinacijo histonov.

---

1.5 POLY ADP-RIBOZILACIJA

Afiniteta te modifkacije na histonih je: H1>H2A>H2B=H3>H4. Encim, ki dodaja ADP-riboze je Poly ADP-riboza polimeraza-1 (PARP-1). Ob manjših poškodbah DNA, aktivacija PARP-1 povzroči kovalentno modifikacijo histonov. Poly ADP-riboza ima visok naboj, to pa povzroči, da z njo modificirani histoni, izgubijo afiniteto do DNA, tako pa pride do lokalne dekondenzacije kromatina.

---

1.6 BIOTINILACIJA

Je proces kovalentne vezave biotina na proteine. Biotinilacija lizinov na histonih se poveča kot odgovoru na proliferacijo limfocitov. Raziskave so pokazale, da je količina biotiniliranih histonov veliko višja v transkripcijsko neaktivnem kromatinu. To pa pomeni, da biotin sodeluje pri utišanju genske ekspresije. Biotinilacija se poveča ob izpostavitvi celic UV svetlobi.

---

1.7 KARBONILACIJA

Je oksidativna modifikacija histonov. Poteka na histonih: H1, H2A, H2B in H3. Na histonu H4 je še niso odkrili. Karbonilacija oksidira nekatere aminoksiline na histonih in s tem poveča pozitivni naboj histona. Tako se poveča afiniteta do DNA. Karbonilacija je neencimska modifikacija, poveča pa se ob alkalnem stresu, povezana pa je tudi s staranjem.

---

1.8 METILACIJA

Metilacija povzroči bolj kondenzirano obliko kromatina. To pomeni, da metilacija histonov oteži proces transkripcije ali popravljanja DNA. Poteka predvsem na lizinu/argininu histonov H3 in H4. Vsak lizin je lahko do trikrat metiliran. Aktivacija oziroma represija transkripcije je odvisna od količine metilacije. Je obstojnejša modifikacija od acetilacije.

Metilacijo katalizirajo metiltransferaze (HKMT). Ti encimi imajo širok spekter delovanja. Prisotni so tako pri formaciji heterokromatina, kot pri regulaciji transkripcije.

Ker metilacija ne spremeni naboja lizina ali arginina, na kromatin ne vpliva preko elektrostatskih pač pa drugih (hidrofobnih itd.) interakcij. Lahko pa specifična metilacija aminoksilin, predstavlja vezavno mesto za različne proteine.

Procesi na katere vpliva metilacija:

-Popravljalni mehanizem DNA in transkripcijska aktivnost DNA -H3 (lizin 9 in 27; trikrat metilirana), pomemben za močan stabilen kromatin -H3 (lizin 9; dimetiliran) pomemben za gensko ekspresijo -H4 (lizin 20; trimetiliran) predstavlja znak za raka pri človeku -H3 (lizin 9; trimetiliran) pomemben pri mitozi

---

1.9 ACETILACIJA

Acetilacija poteka na N-terminalnem delu proteina, predvsem na lizinskih ostankih vseh štirih histonov, ki tvorijo nukleosom: H2A, H2B, H3, H4. Transkripcijsko aktivna mesta evkromatina so hiperacetilirana, mesta neaktivnega heterokromatina pa so hipoacetilirana.

Acetilacijo regulirata histonska acetiltransferaza (HAT) in histonska deacetilaza (HDAC). Poznamo dve vrsti HAT encimov. Tip A se nahaja v jedru, tip B pa v citoplazmi. Tip B acetilira na novo nastale histone v citoplazmi. Ti se nato transportirajo v jedro, deacetilirajo in vključijo v kromatin. Tip A pa acetilira histone v jedru. Vloga HDAC pa je vzdrževanje ravnotežja med acetiliranimi in deacetiliranimi nukleosomi.

Procesi na katere vpliva acetilacija histonov:

- Transkripcijska aktivnosti kromatina

- Replikacija

- Nastanek nukleosoma

- Proces pakiranja kromatina

- Interakcije nehistonskih proteinov z nukleosomom

Acetilacija lizinskih ostankov nevtralizira naboj histonov. To povzroči manjšo afiniteto do DNA. Sledi dekondenzacija DNA in s tem pride posledično do transkripcije.

---

2. p300/CBP

p300 in CBP paraloga ( p300/PCB) sta sprva bila opisana pred 15 leti kot aktivatorja genov cikličnega AMP in kot adenovirus E1A vezavna proteina. Izkazalo se je, da sta animallia - specifična transkripcijska koaktivatorja(mediatorja), ki imata funkcijo pri aktivaciji mnogih transkripcijskih faktorjev vključno s PCAF. Leta 1996 so objavili da ima CBP lastno acetiltransferazno aktivnost in da p300 in PCAF acetilirajo jedrne histone, kot tudi druge transkripcijske faktorje in ne-transkripcijske faktorske tarče.

Istega leta je bila objavljena kristalna struktura p300 HAT domene s kompleksom Lys-COA bisubstrat inhibitorja ter narejene so bile temu pripadajoče biokemične analize encima. Struktura je razkrila podaljšano globularno domeno, ki vsebuje v sredici 7 β listov obdanimi z 9 α vijačnicami in mnogimi zankami. [1]

En predel Lys-CoA inhibitorja je postavljen približno v sredini( med β4 in β5) in nasproti širokem robu β lista in C-terminalnih koncih dveh vijačnic (α3 in α4). Približno 25 aminokislinskih ostankov dolga zanka(L1), imenovana substrat vezalna zanka, ovija nasprotno stran Lys-CoA inhibitorja. Primerjava med Gcn5/PCAF in MYST HATs odkriva strukturno ohranjenost znotraj osrednje regije, ki je povezana z vezavo kofaktorja acetil-CoA, in čeprav med njima ni sekvečne homologije, obstaja pomembna strukturna različnost ki obdaja to osrednjo jedrno regijo (slika 1a-c). Čeprav med HAT obstajajo podobnosti znotraj vezalne domene kofaktorja acetil-CoA, je L1 substrat vezalna zanka edinstvena značilnost p300 HAT domene, ki vsebuje tretjino CoA deleža Lys-CoA inhibitorja in sodeluje v polovici CoA interakcij. Obstaja mnogo drugih strukturnih značilnosti p300 ki odstopajo od Gcn5/PCAF in MYST HATs, ki kot zgleda so zelo pomembni za p300-specifično HAT funkcijo. Najbolj pomembna je elektrostatična površina v bližini lizinskega predela Lys-CoA inhibitorja, ki je negativna(slika 2a), medtem ko odgovarjajoče regije Gcn5/PCAF in MYST HATs so dokaj nepolarne. Elektro negativna površina p300 vsebuje dve vdolbini ločeni z razdaljo, ki je približno dolga 3-4 aminokislinskih ostankov. Glede na opažanja, poravnava vseh poznanih p300/CBP substratov nakazuje, da vsi vsebujejo bazično aminokislino, ki je 3 ali 4 ostankov gor ali dol od tarčnega lizina. Liu je pokazal, da mutageneza elektronegativnega mesta poveča KM za histonski H3 substrat, kar potrjuje pomembnost tega mesta za protein substratno vezavo p300.

---

3. Rtt109

Rtt109 je primer histon acetiltransferaze (HAT), ki katalizira acetilacijo Lys56 na globularni domeni histona H3. Ta reakcija je izrednega pomena pri pravilni lokalizaciji telomerov. Rtt109 s to reakcijo spodbuja genomsko stabilnost in odpornost DNA na genotoksične snovi ter pravilno transkripcijo genov. Za uspešno acetilacijo H3K56 Rtt109 potrebuje histonske šaperonske proteine, Asf1 ali Vps75. Raziskava strukture Rtt109 je razkrila sedem centralnih ß-ploskev, stranske helikse in substrat vezavno zanko, ki igra analogno vlogo v Ac-CoA interakciji. Zanimivo je, da primerjava sekvence med p300 in Rtt109 razkrije le 7% sekvenčno identiteto, kar je značilno za primerjave nesorodnih proteinov. To se vidi tudi pri substrat vezavnemu mestu, ki pri Rtt109 ni tako elektronegativno kot pri p300. Asp89 igra pomembno vlogo v stabilizaciji substrat vezavne zanke, asparaginski ostanki 287 in 288 sodelujejo pri vezavi substrata, Tyr199 in Trp222 pa igrata pomembni vlogi v katalizi z možnim učinkom na vezavo kofaktorjev. Katalitično aktivno mesto Rtt109, predstavlja ga Asp288, ki je deprotoniran ostanek in Lys290, ki je avtoaciliran ostanek.

Študije kinetičnih lastnosti te katalize so razkrile nenavadno sigmoidna koncentracijsko odvisnost, ki predstavlja visoko stopnjo kooperativnosti. Acetilacija Lys290 olajša H3K56 acetilacijo poleg tega pa tudi spodbuja genomsko stabilnost. Najprej se na kompleks Rtt109-Vps75 veže acetil-CoA, nato sledi vezava N-končnega repa H3. Acetil-CoA napade amino skupino lizina in sledi prenos acetilne skupine na tarčni lizinski ostanek. Rtt109 in Vps75 oblikujeta stabilen kompleks z nanomolarno afiniteto Kd=10+/-2 nM.[16]. Premer centralnega jedra holoencima je približno 12 A.[2]

---

4. LSD1

Metilacijo izvajajo encimi imenovani metiltransferaze. Reakcija je reverzibilna, za kar poskrbijo histon demetilaze. Primer slednjih je LSD1 (lizin specifična demetilaza 1 ). Spada k flavin adenine dinukleotid (FAD) – odvisni amino oksidazni družini in je specifičen za mono- in dimetilirane lizine, ne pa za tri-metilirane lizine. Sprva je bil LSD1 identificiran kot podenota histon deacetilaznih kompleksov. Mehanizem: Metilacijo z LSD1 lahko prikažemo z amino oksidaznim mehanizmom, pri katerem se vez metil-lizin oksidira v iminski intermediat. Reducirajoči ekvivalenti se, prenesejo na FAD in tako nastane FADH2, ki se vrne v oksidativno stanje skozi redukcijo molekularnega kisika do vodikovega peroksida.

Medtem je metil-lizin imin intermediat podvržen hidrolizi, katere rezultat je demetilacija lizina in sprostitev stranskega produkta; formaldehida.

Struktura LSD1/Co-REST kompleksa: Kristalno strukturo so določili s samomorilskim inhibitorjem sestavljenim iz 21 ostankov histona H3. Inhibitor in LSD1 interagirata skozi serijo glavnih in stranskih verig z tako vodikovimi kot z Van der Waalsovimi vezmi. Pomembnejše povezave z inhibitorjem so vodikove vezi na R2 in Q5 stranski verigi in solni mostiček med alfa-aminom A1 in Asp555 v LSD1. [3]

Kristalna struktura LSD1/Co-REST-C kompleksa: Tu je LDS1 vezan na histon H3 peptidni inhibitor v katerem je Lys4 mutiran v metionin (H3K4M). Vezava peptida je stabilizirana z vrsto inter- in intra-molekularnimi vodikovimi in Van der Waalsovimi vezmi. Za pravilno interakcijo in konformacijo z LDS1, je pomembno veliko vodikovih vezi in solnih mostičkov z R2 in R8 guanidnimi skupinami v H3K4M. Da encim LSD1 katalizira demetilacijo, potrebuje H3 peptide dolge vsaj 16 ostankov.

Zanimivo je dejstvo, da je konformacija H3K4M peptida oblike črke U, medtem ko je konformacija samomorilskega inhibitorja oblike W. LSD1 substrat vezavno mesto, je tako sposobno sprejeti substrate v več različnih konformacijah. Rezultati kažejo da lahko androgeni receptor in ostali transkripcijski faktorji regulirajo aktivnost LSD1, se pravi, da lahko spremenijo konformacijo LSD1 substrat vezavnega mesta.

5. Reference

[1] Ronen M., Raymond C. T., Histone modifying enzymes: Structures, mechanisms, and specificities, Biochimica et Biophysica Acta 1789 (2009) 58–68.

[2] Lin C., Yuan YA., Structural insights into histone H3 lysine 56 acetylation by Rtt109, 2008 Oct 8;16(10):1503-10. Epub 2008 Aug 21.

[3] Dan S., Qi H., Hui z., James R.T., Rui-Ming X., Zhiguo Z., Georges M., citing online sources, Structure and histone binding properties of the Vps75-Rtt109 chaperone-lysine acetyltransferase complex [online], 2011, [citirano 15.4.2011], dostopno na svetovnem spletu: <http://www.jbc.org/content/early/2011/03/22/jbc.C111.220715.full >.

[4] Brittany N. A., John M. D., Kinetic mechanism of a novel HAT-histone chaperone complex, Rtt109-Vps75, [online], 2011, [citirano 15.4.2011], dostopno na svetovnem spletu: <http://www.fasebj.org/cgi/content/meeting_abstract/24/1_MeetingAbstracts/458.1>.

[5] Yong T., Marc A. H., Neda D., Hugo W., Benoit G., Katrina M., Hua Y., Paul D., Eun-Hye L., Chantal D., Pierre T., Alain V., Philip A. C., Ronen M., structure of the Rtt109-AcCoA/Vsp75 Complex and implications for Chaperone-mediated histone acetylation, Volume 19, Issue 2, 221-231, 20 January 2011.