Klinični preizkusi z učinkovinami na osnovi RNAi

Starostne degeneracije makule (AMD)

Prvo in najuspešneje zdravljenje z RNAi se je uporabilo za preprečevanje starostne degeneracije makule. Tu RNAi deluje na vaskularni endotermski rastni faktor. Rasni faktorji so proteini, ki pospešujejo celično rast, diferenciacijo in kronična vnetja. Vežejo se na svoje receptorje na površini celice. To povzroči dimerizacijo receptorjev kar sproži tirozinsko kinazno, ki pospeši kaskadne reakcije. Posledica teh so proliferacija endotelijskih celic in neovaskularizacija, pa tudi povečana žilna permeabilnost. Pri bolezni AMD WEGF mutira - tako je tirozinska kaskada stalno aktivna. Žile in krvna telesa postanejo neobičajne, iz njih prične izpuščati tekočina, kar povzroči odstop rumene pege in njeno nabreklost. Zato oboleli izgubi vid. Zdravljenje AMD z RNAi je prestalo klinično fazo 1 in fazo 2. Problem pri drugih delovanjih RNAi je predvsem dostava le-te v želene celice. Tu pa so uporabili najlažji način dostave gole RNAi, saj so jo enostavno vbrizgali v bližino ciljnih celic, se pravi v oko. Ni še jasno, zakaj to pri nekaterih celicah kot so očesne, pljučne in centralno živčne sistemske in druge celice lahko storimo in zakaj pri drugih tega ne moremo. Te celice same spustijo siRNA v citoplazmo, kjer RNAi sistem deluje. Pacientu injeciramo siRNA v slani fiziološki raztopini ali drugi pomožni snovi, npr. 5% dextroze direktno v oko. Pri raziskavi so injecirali za eno dozo zdravila od 100-1600 µg. To so AMD pacienti dobro prenesli pa tudi nobena doza ni bila toksična. Po 2 tednih so rezultati pokazali, da so bile najbolj učinkovite manjše doze. Tretjo fazo preizkušanja so raziskovalci prekinili, saj so ugotovili, da preizkušanje v fazi 2 ni potekalo v zadano smer. Kljub temu, da podjetje ni zaznalo sistemskih varnostnih napak in da zdravljenje ni škodilo očesu, so leta 2009 zdravilo umaknili iz preizkušanja. Poleg tega so pri poizkusih za simptom horoidalna neovaskularizacija ugotovili, da zdravilo ne deluje preko utišanja genov, temveč po drugi poti, ki lahko povzroči angiogenezo, ki se je izkazala za škodljivo. Tega pa niso ugotovili pri drugih poizkusih z RNAi. Zato je zdravljenje AMD z RNAi še vprašljivo. Razvoj so nato preusmerili na zdravljenje diabetične retinopatije.

Respiratoni sincicijski virus (RSV)

Podobno je zdravilo z minimalno spremenjeno RNAi proti respiratoni sincicijski virusni mRNA, ki omogoča izražanje kapsidnega proteina. RSV je eno verižni RNA virus iz družine paramyxoviridae, ki povzroča infekcijo dihalnih poti ljudi vseh starosti. Poizkus z dvojno placebo kontrolo je v fazi 2. Zdravilo so dnevno dajali pacientom preko pršila za nos 2 dni pred in 3 dni po okužbi. Opazili so 38% izboljšanje.

Prirojena motnja keratina (PC)

Prirojena motnja keratina ali PC je redka a zelo boleča bolezen, ki prizadane kožo, nohte in usta. Povzroča jo mutacija gena enega od štirih keratinov. Najpogostejši je K6a. Razvili so zdravilo, ki vsebuje RNAi, ki selektivno deluje na utišanje tega gena. Vendar pa so raziskave še v klinični Fazi1. Tudi ta se uporablja lokalno direktno na kožo z mikro iglicam. Preiskovanim pacientom so jo vbrizgavali vsake dva tedna. Preiskus je trajal 14 tednov. Kljub temu, da je bil viden napredek zdravljenja pa so ga preiskuševanci težko prenašali še posebej zaradi rednega injeciranja. Tako se podjetje sedaj trudi najti drug način uporabe zdravila. Fokusirajo se na alternativni tehnologiji dosteve kot so na lipidih bazirane kreme, ki vsebujejo RNAi in so take, da lahko prodirajo v kožo. V poštev pa pridejo tudi topne mikroiglice, ki se premaknejo v epidermis in nadzorovano sprostijo njihovo vsebino.

Huntingtova bolezen

Huntingtova bolezen je usodna dominantna nevrodegenerativna bolezen, ki jo povzroči ponovitev trinukleotida CAG (glutamin) v prvem eksonu gena za protein poimenovanega huntingtin. Vsi ljudje imamo gen za ta protein, vendar pa se dolžina zaporedja glutaminov razlikuje pri vsakem posamezniku. Čim je zaporedje daljše od 28-36 ponovitev, v celicah nastaja mutirana oblika proteina, ki vodi do pojava bolezni. Zaenkrat še ni nobenega zdravljenja bolezni, vendar pa RNAi tehnologija kaže obljube na transgenih modelih miši. Uspelo jim je zmanjšati ekspresijo mutiranega proteina ter tako upočasniti napredovanje bolezni. Uporabili so mezenhimske matične celice, ki imajo poleg številnih prirojenih terapevtskih učinkov tudi sposobnost prenašanja večjih molekul, celo organelov, zato so jih uporabili kot vektor za prenos RNAi. Interferenčna RNA deluje na mutiran huntingtin v nevronskih celičnih linijah kot tudi na reporterske gene. Slednji so zelo uporabni za ugotavljanje izražanja določenega gena na podlagi florescenčnega obarvanja (GFP) ali luminiscence (luciferin). shRNA komplementarna proteinu huntingtinu je zmožna zmanjšanja stopnje izražanja mutiranega proteina iz kar dveh celičnih linij – celični liniji nevroblastoma (SH-SY5Y) in celični liniji glioblastoma (U87). Prav tako tudi shRNA komplementarna zelenemu florescenčnemu proteinu zmanjša njegovo ekspresijo v eni izmed celičnih linij. Ti rezultati so spodbudni za izboljšanje terapevtskih postopkov z uporabo RNAi in matičnih celic za prihodnje obravnave Huntingtonove bolezni.

Bronhialna astma

Bronhialna astma je resna kronična bolezen z raznimi kliničnimi simptomi. Povzroči jo kombinacija genetskih in okoljskih faktorjev, zaradi onesnaženosti okolja pa je vse bolj pogosta. Patogenske študije razkrivajo, da je za astmo značilen vdor limfocitov v bronhialno sluz zaradi omejene dihalne poti, povečano je število eozinifilnih granolocitov (znak okužbe). Glavna tarča RNAi zdravljenja je interlevkin 23. IL-23 je pomemben pri vnetnem odgovoru proti okužbam in prek Th17 celic (povzročiteljic vnetja) skrbi za usmerjanje limfocitov T. IL-23 in Th17 celice sta kjučna tudi za razvoj avtoimunih bolezni. Pri raznih pljučnih boleznih kot sta astma in kronična obstruktivna pljučna bolezen so dejansko detektirane visoke stopnje serumskega IL-23 in IL-17. Slednji je proizvodnik Th17 celic. Predpostavljali so, da bi utišanje regulacije IL-23 lahko zmanjšala vnetja dihalnih poti in omilila resnost z alergeni spodbujeno astmo. Za preizkuse uporabljajo ovalbumin (za spodbuditev alergijskih reakcij), na katerega so miške zelo občutljive in tako smatrane za model miške z bronhialno astmo. Da bi ovrednotili vpliv utišanja IL-23 z RNAi na razvoj in resnost astmatičnega vnetja so naredili plazmid, specifičen za IL-23 in izražujoč shRNA. Miške so plazmid inhalirale, kar je zmanjšalo stopnjo IL-23 v pljučnem tkivu za skoraj 75%. Utišanje ekspresije IL-23 je tudi dramatično zmanjšalo število eozinofilcev, indikatorjev okužbe, in nevtrofilcev, čigar naloga je fagocitoza ter omilila vnetje v pljučih astmatičnih miši.

Virus HIV

Z RNAi ni možna le obramba pred virusi, ampak tudi zdravljenje. HIV-1 kronično prizadane posameznike in tako zahteva dolgotrajno zdravljenje z RNAi. Razvoj virusne rezistence je glavna prepreka pri HIV terapijah, zaradi nastajanja novih mutiranih virusov. Pokazano je bilo, da predolga infekcija celic z enakim zaporedjem siRNA proti virusu HIV povzroči evolucijo pobeglih virusov, odpornih na to specifično siRNA. Strategija za doseg dolgotrajne učinkovitosti RNAi je ublažiti pobeg virusa. Tarča raziskovalcev so evolucijsko ohranjene sekvence nespremenjene pri večih rodovih virusov, kar zmanjša možnost mutacij. Zagotoviti je potrebno tudi veliko siRNA z različnimi zaporedji, kar pa zmanjšuje pobeg virusa. Lani so identificirali 273 genov gostiteljskih faktorjev ključnih za replikacijo virusa. Njihova odsotnost se kaže kot inhibicija produkcije kapsidnega proteina –p24 ali pa kot inhibicija aktivnosti virusnih genov. Potencialne tarče RNAi so torej virusno-gostiteljske interakcije. Usmerjanje siRNA molekul na evolucijsko ohranjena mesta virusa in ciljanje gostiteljskih faktorjev nujnih za preživetje virusa kažeta na preprečenje pobega virusov kot tudi dolgotrajnejšo inhibicijo. Gostiteljski faktorji ključni za vstop virusa in njegovo replikacijo prestavljajo odlične tarče za molekule.

Viri

[1] Olson, S. D. et al. Examination of mesenchymal stem cell-mediated RNAi transfer to Huntington's disease affected neuronal cells for reduction of huntingtin. Molecular and Cellular Neuroscience, 2012, letn. 49, št. 3, str. 271-281

[2] Uprichard, S. L. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters, 2005, letn. 579, št. 26, str. 5996–6007

[3] Zhou J., Rossi JJ. Current progress in the development of RNAi-based therapeutics for HIV-1. Gene Therapy, 2011, letn. 18, str. 1134-1138

[4] Yanchun, Li et al. Silencing IL-23 expression by a small hairpin RNA protects against asthma in mice. Experimental and molecular medicine, 2011, letn. 43, št. 4, str. 197-204

[5] http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Huntingtonova_bolezen

[6] Tiemann, K., Rossi, J.J. RNAi-based therapeutics–current status, challenges and prospects. EMBO Molecular Medicine, 2009, letn. 1, str. 142-151

[7] Aliabadi, H. M. et al. Supramolecular assemblies in functional siRNA delivery: Where do we stand? Biomaterials, 2012, letn. 33, št. 8, str. 2546–2569