Forenzika, Determining the Body Fluid Origin

UVOD

Mikro-RNA so majhne nekodirajoče verige RNA, ki negativno regulirajo (zavirajo) izražanje genov na stopnji translacije. Molekule dolge le od 21-25 nukleotidov imajo v forenzični znanosti velik pomen. V celici imamo okoli 50.000 verig posamezne miRNA, torej jih je res v izobilju, poleg tega pa so zaradi svoje dolžine manj dovzetne za razgradnjo. Pomemben je podatek, da so miRNA tkivno specifične. miRNA se specifično izraža v za forenziko pomembnih telesnih tekočinah, npr. v krvi, slini. Cilj študije je bilo razviti postopek, s katerim bi hkrati izolirali miRNA in DNA. Z analizo bi dobili DNA-profil osebe ter tudi identificirali telesno tekočino, iz katere so DNA pridobili. Dosedanja praksa je temeljila na standardnem ločevanju DNA in mRNA faze. Tukaj pa so želeli doseči izvedbo izolacije in analize brez vmesne separacije DNA in miRNA. Rezultat je le en sam elektroferogram s profilom DNA pridobljene iz telesne tekočine in tudi identifikacija te določene telesne tekočine. S tem bi tudi zminimizirali količino telesnih tekočin potrebne za določen test. S študijo so želeli le dokazati, da je ta koncept izvedljiv. Na ta način sta ta dva podatka neposredno povezana, kar ima velik pomen za forenziko.

METODE

DNA in miRNA so izolirali iz krvi in sline. Sledila je cDNA sinteza z uporabo PCR s stebelno zanko s sledečo reverzno transkripcijo. Ekstrakte DNA in cDNA, sintentizirane iz markerjev miRNA specifičnih za določeno telesno tekočino, so analizirali za STR (mikrosateliti oz. kratke tandemske ponovitve) z malce nadgrajenim ABI AmpFlSTR® NGM SElect™ kompletom reagentov. V kompletu reagentov so bili začetni oligonukleotidi za pomnoževanje kar 17 lokusov. Pri vseh vzorcih je bil prisoten popoln profil DNA z dodatnimi vrhovi miRNA markerja. V vseh primerih so vzorci krvi kazali vrh odgovarjajoč pristotnosti za kri specifičnega miRNA markerja, prav tako je vrh vzorca sline kazal na prisotnost miRNA markerja za slino. Smerna začetna oligonukleotida obeh miRNA sta bila dodatno označena še s florescentnimi barvili za lažjo zaznavo. Analiza fragmentov je bila nato izvedena s kapilarno elektoforezo. Z njo so zaznali prisotnost določenega amplikona miRNA.

REZULTATI IN RAZPRAVA

Cilj študije je bil razviti test hkratne analize DNA in miRNA, kar so dosegli z modifikacijo že obstajajočega testa za profiliranje DNA, ki vsebuje tudi DNA začetne oligonukleotide iz Evropske standardne zbirke. V postopku so dodatno uporabili začetne oligonukleotide za miRNA iz vzorcev krvi in sline ter korak cDNA sinteze.

Kri in slino je darovalo pet prostovoljcev. Pri vseh petih se je DNA-profil ujemal z referenčnim vzorcem njihove DNA, prav tako je bila telesna tekočina pravilno identificirana. V vseh primerih so imeli 100% uspeh. Pozitivne kontrole so bile pričakovanih velikosti. Pri negativnih kontrolah ni prišlo do pomnoževanja miRNA. Skrbel jih je korak reverzne transkripcije, zaradi možnosti vključitve v vzorcu prisotne DNA. To so ovrgli, saj so bile negativne kontrole prazne, ni prišlo do amplifikacij. Ko pa so negativne kontrole reverzne transkripcije dali na kapilarno elekroforezo, so dobili le profil človeške DNA. Na elektoferogramu ni bilo prisotnih prav nič amplikonov miRNA, kar kaže na pravilno karakterizacijo miRNA. Zanimala jih je tudi meja detekcije miRNA. Naredili so serijske redčitve, in sicer so začetno koncentracijo DNA vsakokrat redčili za faktor 10. miRNA so lahko detektirali tudi pri koncentraciji 1 pg/μl DNA. Standard pri DNA analizi je koncentracija od 0,5-1 ng/μl, kar pomeni, da bi v primerih, kjer ni možno napraviti celotnega profila DNA, vseeno lahko identificirali vsaj za katero telesno tekočino gre. V nekaterih primerih je ključno potrditi ali je analizirana DNA prišla iz krvi ali npr. iz sline. Če imajo le sledi krvi, ne morejo zatrdno trditi ničesar. S to metodo lahko identifikacijo telesne tekočine povežejo trdno skupaj z DNA-profilom določene osebe. V prihodnosti si želijo svoj opus specifičnih miRNA markerjev razširiti. Radi bi znali določiti tudi spermo, vaginalni material, menstrualno kri in venozno kri.

Članek

Van der Meer, D., Uchimoto, M. L., Williams, G. Simultaneous Analysis of Micro-RNA and DNA for Determining the Body Fluid Origin of DNA Profiles. Journal of Forensic Science, 2013, letn. 58, št. 4, str. 967-971 (doi: 10.1111/1556-4029.12160)