Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela

UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve in mandeljni. Najbolj pogost komercialni vir β-galaktozidaze pa predstavljajo glive. β-galaktozidaza se v industriji najbolj uporablja za hidrolizo laktoze do monosaharidov pri proizvodnji mleka in mlečnih izdelkov brez laktoze. Hrana brez laktoze je še posebej pomembna za laktozno intolerantne posameznike, ki imajo zmanjšano sposobnost presnavljanja laktoze. Laktozna intoleranca ali hipolaktazija je presnovna motnja, ki nastopi zaradi pomanjkanja β-galaktozidaze v prebavnem sistemu. To ni zgolj motnja, ampak je lahko tudi genetsko posredovana lastnost. Pri laktozno intolerantnih posameznikih lahko zaužitje laktoze povzroči napihnjen trebuh, krče, diarejo, slabost in bruhanje. Najpogostejši pristop za zmanjšanje stranskih učinkov je izogibanje uživanja hrane, ki vsebuje laktozo, vendar hrana brez laktoze lahko povzroči pomanjkanje kalcija, fosforja in nekaterih vitaminov, kar lahko vodi v demineralizacijo kosti. Nezaželene stranske učinke lahko zmanjšamo tudi z zaužitjem β-galaktozidaze. Na tržišču le-ta obstaja v tekoči obliki ali pa je imobilizirana za oralni vnos pred zaužitjem hrane, ki vsebuje visoke koncentracije laktoze. Za ti dve obliki encimov ni nujno da hidrolizirajo 100% zaužite laktoze, saj se encimi lahko razgradijo že takoj ob stiku s prebavnim traktom, prav tako se lahko tudi matriks na katerem so imobilizirani encimi in posledično se iz njega encimi sprostijo prehitro. Alternativa temu bi bila uporaba prepustnega polimernega matriksa z aktivno površino, ki omogoča kemijsko adsorpcijo β-galaktozidaze za poznejše sproščanje encima. V tem primeru se nadzoruje sproščanje encima za povečanje življenjske dobe v prebavnem traktu. Iz tehnološkega vidika so polisaharidni hidrogeli zanimive alternative za polimerne matrice pri proizvodnji tablet z nadzorovanim sproščanjem. Biorazgradljivost, biokompatibilnost in ne toksičnost hidrogelov so odlične lastnosti za biološke, farmacevtske in medicinske aplikacije.

CILJ RAZISKAVE V tem raziskovalnem projektu so sintetizirali hitozanski hidrogel in ga uporabili za imobilizacijo in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze pri laktozno intolerantnih posameznikih in za pridelavo hrane z nizko vsebnostjo laktoze.

POSTOPEK DELA Pripravili so kopolimeriziran hitozanski hidrogel z akrilno kislino, kateremu so merili kakšna je stopnja nabrekanja. Najbolj učinkovita absorpcija je pri višji temperaturi zaradi destabilizacije mrežnih stikov, kar povzroči razširjanje matriksa po tem, ko voda difundira v pore. β-galaktozidazo so imobilizirali tako, da so posušeni hidrogel potopili v raztopino β-galaktozidaze, po 240 minutah je matrica dosegla nasičenje in adsorbiralo se je 16,8 mg β-galaktozidaze na g suhega hidrogela. Za preverjanje encimske aktivnosti so hidrogel, ki je vseboval imobilizirane β-galaktozidaze presneli v raztopino laktoze in nastalo glukozo v raztopini analizirali v časovnih intervalih. Največja encimska aktivnost je na začetku, sledi hitri upad, vendar aktivnost potem ostaja konstantna. Spremljali so tudi aktivnost β-galaktozidaze po ponovni uporabi hidrogela z imobiliziranimi encimi. Encimska aktivnost je med seboj primerljiva v petih zaporednih ciklih katalize. Nato so aktivnost preverjali tudi v mleku in s tem je nastalo mleko z nizko vsebnostjo laktoze. V industriji bi to predstavljalo nižje stroške procesa, saj so imobilizirani encimi dovolj učinkoviti, predvsem pa so lahko ponovno uporabljeni za hidrolizo laktoze. Namen te raziskave je ugotoviti ali je hitozanski hidrogel primerna matrica za nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze. Hidrogel, ki vsebuje imobilizirane encime so prenesli v raztopino laktoze in po 240 min namakanja je bil le-ta odstranjen. Po 120 min so merili glukozno koncentracijo, ki je kontinuirano naraščala v odsotnosti imobilizirane β-galaktozidaze, za kar so predpostavljali, da so encimi difundirali iz notranjih por hidrogela v raztopino med prvimi 240 min in kasnejšo hidrolizo laktoze. Pregledali so tudi kako pH vpliva na sproščanje encimov iz hitozanskega hidrogela. Pri višjem pH se sprosti več encimov kot v primerjavi z nizkim pH, kar predstavljaj obetajoč sistem sproščanja encimov pri kislem pH.

ZAKLJUČEK Na podlagi podatkov pridobljenih v tej raziskavi je mogoče najti uporabnost hitozanskih hidrogelov za številne aplikacije, ki vključujejo hidrolizo laktoze. Imobilizirane encime, kot je β-galaktozidaza, se lahko uporablja večkrat v poroznih hidrogelih brez izgube aktivnosti in tako ustvarjajo poceni proizvodne procese pri pridelavi hrane brez laktoze. Uporabnost poleg živilske industrije obstaja v medicini in farmacevtski industriji. Nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela bi pretvorilo laktozo v glukozo v laktozno intolerantnih posameznikih pri več kot enem ciklu katalize brez izgube encimske aktivno