Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

UVOD

Helicobacter pylori je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu Helicobacter, ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam. Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

POTEK RAZISKAVE

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice E. coli TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah E. coli BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

REZULTATI

Novonastala knjižnica mutantov v celicah E.coli je vsebovala 4.0 x 10⁷ različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH. Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete. Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH. Inkubacija HMR23 s H.pylori je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL. Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

DISKUSIJA

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.