Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

Uvod

Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo. Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P., and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov. Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari, E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb. CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>. V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.