Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

Uvod

Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo. Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije s škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,and Gagneux,S. (2012).Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,and Kishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,and Musser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,and Lipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P.,and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,and Yuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,and Tavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov. Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari, E., and Lin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb. CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>. V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

Adaptivna krajina

Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L.(2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>. Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih <ref name="ref15">Lenski,R.E.,Mongold,J.A.,Sniegowski,P.D.,Travisano,M.,Vasi,F.,Gerrish,P.J.,and Schmidt,T.M (1998).Evolution of competitive fitness in experimental populations of E. coli: what makes one genotype a better competitor than another? Antonie van Leeuwenhoek 73, 35–47.</ref>. Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.

Teorije o populacijski strukturi med aseksualno evolucijo

Teorija klonske zamenjave (ang. clonal replacement) je najbolj enostavna teorija. Predvideva, da tekom adaptivne evolucije nastane mutant z boljšim genskim doprinosom v danem okolju. Mutant v naslednjih generacijah povečeval svoj delež in v končni fazi nadomestil starševsko populacijo. Teorija velja za primere, ko je populacija majhna in je čas med zaporednimi mutacijami bistveno daljši kot čas potreben za zamenjavo klonov. Predvideva fiksacijo zgolj ene mutacije ob danem času in homogenost populacije, če ta ni v obdobju menjave klonov <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>. Druga teorija je teorija klonske interference (ang. clonal interference). Ta teorija predvideva, da se lahko v populaciji, ki je podvržena adaptivni evoluciji, hkrati nahaja več linij kolonov s koristnimi mutacijami, ki med seboj tekmujejo za vire do popolne prevlade enega klona. Prevladujoč klon je nova starševska generacija za naslednji krog mutageneze. Tudi ta teorija predvideva, da je možna fiksacija zgolj ene mutacije v populaciji ob danem času. Populacije so homogene, razen takoj po nastanku mutacije <ref name="ref17">Gerrish,P.J.,and Lenski,R.E.(1998).The fate of competing beneficial mutations in an asexual population.Genetica 102–103, 127–144.</ref><ref name="ref18">Orr,H.A.(2000).The rate of adaptation in asexuals. Genetics 155, 961–968.</ref><ref name="ref19">Gerrish,P.(2001).The rhythm of microbial adaptation. Nature 413,299–302.</ref><ref name="ref20">Kim,Y.,and Stephan,W.(2003).Selective sweeps in the presence of interference among partially linked loci.Genetics 164, 389–398.</ref> <ref name="ref21">Campos, P.R.,and de Oliveira,V.M. (2004).Mutational effects on the clonal interference phenomenon.Evolution 58, 932–937.</ref><ref name="ref22">Wilke,C.O.(2004).The speed of adaptation in large asexual populations.Genetics 167, 2045–2053.</ref>. Tretja torija je večmutacijski model (ang. multiple-mutation model). Predpostavlja, da lahko v populaciji hkrati pride do fiksacije več koristnih mutaciji. Takšna populacija lahko nastane, če je populacija dovolj velika ali pa če je frekvenca mutacij dovolj visoka. Oboje privede do tega, da se lahko v populaciji pojavi več mutacij hkrati, preden pride do fiksacije v populaciji <ref name="ref16">Desai, M.M.,Fisher,D.S.,and Murray,A. W.(2007).The speed of evolution and maintenance of variation in asexual populations. Curr.Biol. 17,385–394.</ref>. V praksi so populacije mikroorganizmov dovolj velike, da veljata druga ali tretja teorija.

Faktorji, ki vplivajo na dinamiko adaptivne evolucije

Na dinamiko adaptivne evolucije vplivajo faktorji kot so frekvenca mutacij, relativna razlika v genskem doprinosu in frekvenca koristnih mutacij. Dinamika adaptivne evolucije je neposredno povezana s frekvenco mutacij. Zato bi pričakovali, da bi večja frekvenca mutacij pospešila adaptivno evolucijo, ker bi vodila v večjo diverziteto. V praksi se pokaže, da to ni vedno tako <ref name="ref23"> Arjan,J.A.,Visser,M.,Zeyl,C.W.,Gerrish,P.J.,Blanchard,J.L.,and Lenski,R.E (1999).Diminishing returns from mutation supply rate in asexual populations. Science 283,404–406.</ref>. Majhna frekvenca mutacij vodi v počasno odkrivanje koristnih mutant, vendar pa prevelika frekvenca mutacij (uporaba mutatorskega seva) vodi do pojavitve škodljivih mutacij in nastanka tihih mutacij, ki povečujejo genetsko breme <ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M., Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J (2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient limited environments in yeast. PLoSGenet. 4, e1000303.doi:10.1371/journal. pgen.1000303</ref><ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> <ref name="ref25">Barrick,J.E.,Yu,D.S.,Yoon,S.H., Jeong,H.,Oh,T.K.,Schneider,D.,Lenski,R.E.,and Kim,J.F.(2009).Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature461, 1243–1274.</ref>.Druga možnost je uporaba mutagena. Ker periodično dodajanje mutagena ni praktično, se uporabljajo mutageni aleli, ki jih induciramo, ko jih potrebujemo. Poleg frekvence mutacije je za dinamiko populacije pomemben faktor tudi čas potreben za fiksacijo alela v populaciji. Čas fiksacije alela je v glavnem odvisen od dveh dejavnikov, in sicer od naključnega toka (genskega zdrsa) in prednosti koristne mutacije v primerjavi z ozadjem. Večji kot je relativni genski doprinos, krajši je čas fiksacije. Za sev z relativnim genskim doprinosom, ki je za 10 % boljši od ozadja, velja, da bo fiksiran v približno 250 generacijah v eksperimentu s prenosom kultur <ref name="ref24">Elena,S.F.,and Lenski,R.E.(2003).Evolution experiment swith microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat.Rev.Genet.4, 457–469.</ref> in v približno 100 generacijah pri uporabi metode kontinuirne kulture<ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>. Genski zdrs pa je definiran kot verjetnost, da sev s koristno mutacijo ne izumre. V in vitro adaptivni evoluciji je glavni vzrok genskega zdrsa naključno odvzemanje vzorcev iz populacije. Zgodi se, ko velik del populacije izgine, kot se to zgodi pri inokulaciji svežega gojišča s prekonočno kulturo. Verjetnost preživetja ugodnega mutanta je odvisna od deleža, ki ga zavzema v inokulumu in količine prenesene populacije. To pomeni, da lahko med prenosom popolnoma izgine zaradi naključnega odvzemanja vzorcev. Tej težavi se lahko izognemo, oziroma jo močno zmanjšamo, z uporabo kontinuirnih kulturnih sistemov<ref name="ref26">Conrad,T.M.,Lewis,N.E.,and Palsson,B.O.(2011).Microbial laboratory evolution in the era of genome-scale science. Mol.Syst.Biol. 7, 509.</ref>.

Vizualizacija evolucije v realnem času

V klasičnem eksperimentu adaptivne evolucije ne vemo, kdaj natančno se pojavi nov klon ali kdaj se zgodi fiksacija mutacije v populaciji. Zato tudi ne vemo, kdaj natančno izolirati seve, da bomo v populaciji zaznali novonastale mutante. Ne vemo tudi, v kakšnih intervalih naj izvajamo mutagenezo. Za rešitev te težave je bila predstavljena metoda vizualizacije evolucije v realnem času VERT (ang. Visualizing evolution in real-time)<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>. Metoda temelji na uporabi izogenih mikroorganizmov, ki pa so različno označeni, najpogosteje s fluorescenčnimi proteini. Takšni mikroorganizmi se označeni z različnimi proteini, a v enakih razmerjih, uporabijo kot starševska populacija. Enako označene celice tvorijo subpopulacije. Ko tekom adaptivne evolucije nastane sev s koristno mutacijo, se v populaciji poveča delež celic, ki so enako označene torej subpopulacije, ki ji pripada ugodni mutant. Povečan delež enako označenih celic je torej znak za nastanek koristne mutacije, ki prinaša večji genski doprinos. Populacijo lahko v vsakem trenutku spremljamo s pomočjo ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS, ang. fluorescence-activated cell sorter) in tako določimo relativne deleže označenih celic. Vsako relativno povečanje deleža enako obarvane subpopulacije imenujemo adaptivni dogodek. Na ta način lahko točno določimo čas nastanka ugodnega mutanta. Vsi adaptivni dogodki nekega eksperimenta pa predstavljajo zgodovino populacije. Tudi iskanje novega ugodnega mutanta je lažje, saj prevladuje v dani subpopulaciji in obstaja večja možnost, da ga najdemo. Ker hkrati spremljamo adaptivne dogodke, lahko v skladu z njimi prilagajo selekcijski pritisk in vodimo populacijo do želenega fitnesa. Trenutno je metoda omejena z izborom dostopnih označevalcev, ki morajo biti dovolj razločljivi med seboj, hkrati pa ne smejo vplivati na fitnes celic. Omejeni smo tudi s tehnologijo zaznavanja označevalcev. Zaznavanje adaptivnih dogodkov je podvrženo raziskovalčevi presoji, saj je težko razločiti šum metode od dejanskega vzpona ugodnega mutanta, računalniški programi za obdelavo tovrstnih informacij pa so še v fazi razvoja<ref name="ref27">Kao,K.C.,and Sherlock,G.(2008).Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.Nat.Genet. 40,1499–1504.</ref><ref name="ref28">Huang,M.,McClellan,M.,Berman,J.,and Kao,K.C.(2011).Evolutionary dynamics of Candida albicans during in vitro evolution. Eukaryot.Cell 10,1413–1421.</ref>.. Izolirane mutante lahko podvržemo vsem metodam omik in natančno preučimo mehanizme prilagoditve na nivoju DNA, RNA, proteinov in metabolitov.

Zaključek

Racionalni dizajn sevov mikroorganizmov danes še ni možen, ker ne poznamo vseh mehanizmov, ki delujejo v ozadju. Zato se poslužujemo metodam kot je adaptivna evolucija, kjer s pomočjo naravne selekcije iščemo organizem z najboljšim fitnesom, hkrati pa preučujemo mehanizme v ozadju, ki vodijo k izboljšanemu fitnesu. Vsaka metoda, ki nam olajša iskanje kandidatov med poskusom je torej dobrodošla.

Reference

<references/>