Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum

Uvod

Uporaba celic za izvajanje računskih operacij je eden večjih ciljev sintezne biologije že od njenega nastanka. Vendar je trenutno kompleksnost izračunov zelo omejena, saj trenutno lahko sestavimo samo 3 slojna logična vezja (vsaka »in« in »ali« vrata predstavljajo en sloj, v primeru sintezne biologije senzorji predstavljajo prvi sloj). Izgradnjo logični vezij z večjim številom elementov otežuje pomanjkljivo število močnih regulatornih elementov, ne željenih interakcij med genetskimi elementi, zahtevnost sestave in vnosa genetskih konstruktov v celice in zahtevno modeliranje in predvidevanje obnašanja vezij. Hkrati nam še vedno manjkajo kriteriji s katerimi bi lahko kvantizirali učinkovitost vezij in naprav s lahko dostopnimi podatki. Ta članek zato predlaga, da bi to vlogo prevzelo razmerje med signalom in šumom v sistemu, v nadaljevanju zapisano kot SNR (signal to noise ratio). S SNR lahko določimo kolikšen problem predstavlja šum napram dejanskemu signalu v našem sistemu. V elektronskih vezjih se SNR analiza uporablja kot orodje za sestavljanje računskih operacij in komunikacij.

Metode in materiali

Booleovi biokemijski signali

Da lahko uporabimo Booleovo logiko v biokemijskih sistemih moramo določiti kateri fizikalna lastnost bo določala abstraktni vrednosti »true« in »false«. Za to vlogo je bilo predlaganih več fizikalnih lastnosti kot so hitrost transkripcije, hitrost translacije, prisotnost ali odsotnost določenih DNA sekvenc, epigenetske oznake na DNA, fluorescenca, emisija in napetost na membrani. Vendar izmed vseh lastnosti je najprimernejša lastnost koncentracija, saj se prenos informacije med elementi v vezju vedno izvede, ko je dosežena primerna koncentracija signalne molekule ali substrata. Koncentracij, ki predstavljajo Booleove vrednosti, lahko kvalitativno cenimo tako, da primerjamo koncentracije v posameznih celicah, ko bi celice morale biti v stanju »true« z koncentracijo, ko bi celice morale biti v stanju »false«. V primeru, da se koncentracijski stanji za »true« in »false« prekrivata težje ločimo med obema stanjema, posledično se nam poslabša kvaliteta signala, zato so za vezja najprimernejši sistemi, kjer se koncentracije za oba stanja ne prekrivajo oz. je prekrivanje čim manjše. V elektromagnetnih sistemih se kvaliteta signala izrazi kot SNR, ki ga najpogosteje merimo na logaritmični skali z decibeli (dB) kot enoto. SNR lahko izračunamo kar z standardno definicijo:

〖SNR〗_dB =20〖log〗_10 A_signal/A_šum

Kjer A predstavlja amplitudo signala in šuma določenega z metodo najmanjših kvadratov (nadaljne kot RMS – root-mean-square). Če to uporabimo to enačbo z Booleovimi signali dobimo sledečo enačbo:

〖SNR〗_dB=20〖log〗_10 (├|µ_true ┤-├ µ_false ┤|)/2σ

Amplituda signala se izračuna kot polovica razlike med vrednosti »true« in »false«, obe vrednosti izračunamo z RMS iz amplitude kvadratnega vala. Šum (σ) se izračuna kot povprečje standardnega odstopanja za stanji »true« in »false«, ki ga izračunamo z RMS amplitude, ki ostane, ko odštejemo izbrani Booleov signal. Na prvi pogled izgleda kot, da lahko uporabimo enako analizo tudi za biokemijske sisteme, vendar to ne drži. Razlog je, da je končni izhodni signal sicer odvisen od celične populacije se celoten proces vezja izvede znotraj ene celice, kjer se koncentracija pri močnem izražanju vede po log-normalni distribuciji (signali imajo ovalno obliko in ne oblike kvadratnega vala). Zato naslednja enačba natančneje opiše SNR:

〖SNR〗_dB= 20〖log〗_10 (├|〖log〗_10 (µ_(g,true) ┤/├ µ_(g,false))┤|)/(2〖log〗_10 σ_g )

µg predstavlja geometrično povprečje signalov »true« in »false«, σg je standardno geometrično odstopanje za obe stanji.

Vpliv moči signala na računske sposobnosti vezja

Vsak element v biološkem vezju vpliva na SNR signala, ki potuje preko njega. Element z močno amplifikacijo in vhodnimi signali, padejo v meje optimalnega delovanja elementa, bo proizvedel »true« in »false« signale, ki so bolj razločni od vhodnih signalov, SNR signala se poveča. Element katerega vnosni signal ni usklajen z njegovimi mejami delovanja ali pa ima slabe amplifikacijske lastnosti bo povzroči slabšo ločitev izhodnih signalov »true« in »false« in s tem znižanje SNR. Zato je potrebno določiti kvaliteto elementa glede na njegov vpliv na SNR signala, to dosežemo z določitvijo razlike med SNR vhodnega signala in SNR izhodnega signala:

〖ΔSNR〗_dB=〖SNR〗_(dB,output)-〖SNR〗_(db,input)

Po tej definiciji so elementi z visokim ΔSNR najprimernejši za izvajanje »računov«. Vpliv elementa na SNR ni enakomeren, ampak je odvisen od okoliščin v katerih deluje. To je neodvisno od dejavnikov kot so metabolno tekmovanje, toksičnost ali translacija čez stop kodon, ampak je to dejstvo inherentna karakteristika nelinearnega odnosa med vhodnim in izhodnim signalom, ki je prisoten pri vseh bioloških elementih. Različne kombinacije nivojev vhodnih signalov in šuma okolja (µg,output, µg,input in σg) proizvedejo različne izhodne SNR-je. Hkrati na izhodni SNR vpliva tudi dinamika vhodnega signala, torej kako pogosto se vrednost vhodnega signala spremeni. ΔSNR za dani element lahko izračunamo iz input/output krivulje, ki nam poda izhodni signal v odvisnosti z vhodnim signalom. Ko je šum izražanja nizek, ΔSNRdB za izbrani element konvergira k maksimalni vrednosti, ki jo določa razlika med razponom vrednosti vhodnega signala in razponom vrednosti izhodnega signala. Kadar pa šum narašča, začne vrednost ΔSNRdB padati dokler šum popolnoma ne prevlada nad signalom.

Izračun ΔSNRdB lahko uporabimo kot prvo stopnjo triaže za določitev uporabnosti biološke naprave za izvajanje digitalnih izračunov. Naprava ni uporabna, če njen ΔSNRdB ni dovolj visok za njen namen, npr. ΔSNRdB v sistemu za uničevanje rakavih celic v organizmu mora biti veliko višji kot v fermentacijskem sistemu, hkrati mora biti ΔSNRdB znotraj območja primernega vhodnega signala. Predpogoj za izvedbo te analize je, da smo karakterizirali odvisnost input/output v SI enotah. Uporabimo SI enote namesto relativnih vrednosti, saj tako ustvarimo osnovo, ki se ne bo razlikovala me različnimi laboratoriji in izvajalci. Širše območje visokega ΔSNRdB-ja imam določen element, lažje ga povežemo z drugimi elementi v vezju, hkrati bomo sestavili biološko napravo, ki je bolj odporna na različne motnje, ki jih vnese njeno delovanje.

Kompleksna vezja

Enako metodo analize učinkovitost, ki smo jo uporabili za en element in posamezno biološko napravo lahko uporabimo tudi za analizo celotnega vezja. Vezje lahko obravnavamo kot bolj zapleteno biološko napravo, zato lahko določimo tudi SNR za njegove vhodne in izhodne signale po enakem postopku. SNR karakteristike vezja, ki ne vsebuje povratnih zank lahko predvidimo z uporabo SNR podatkov posameznih naprav in elementov v vezju. Na takšen način lahko tudi zelo natančno napovemo geometrijsko povprečje signalov in variabilnost ekspresije. hkrati lahko napovemo maksimalni ΔSNRdB iz velikosti vhodnih signalov z uporabo input-output krivulje in ΔSNRdB analiz posameznih naprav. Za napovedovanje totalnega ΔSNRdB lahko uporabimo sledečo formulo:

〖ΔSNR〗_(dB,total)=〖ΔSNR〗_(dB,1) (µ_(g,true),µ_(g,false))+〖ΔSNR〗_(dB,2) (f_1 (µ_(g,true)),f_1 (µ_(g,false)))+〖ΔSNR〗_(dB,3) (f_1 f_2 (µ_(g,true) ),f_1 f_2 (µ_(g,false)))+⋯

Celokupna učinkovitost vezja je funkcija tako SNR-jev posameznih naprav in sovpadanju signalov med posameznima napravama. Ker so ugodna območja visokega SNR pogosto zelo majhna za posamezno napravo je potrebno, da so posamezne naprave med seboj dobro usklajene, saj vsako odstopanje iz tega območja lahko povzroči močno znižanje za SNR za celotno vezje.

Vpliv analiz SNR na sestavljanje vezij

Moramo vedeti, da tudi, če nam SNR analiza določi visok SNR za naše vezje še to ne pomeni, da bo vezje tudi učinkovito delovalo. SNR analiza nam samo poda informacijo o učinkovitosti prenosa signala med posameznimi napravami ne zagotovi pa, da bo naprav delovala tako kot želimo. Vendar, če imamo nizek SNR je skoraj garantirano, da vezje ne bo sposobno izvesti željene funkcije. Torej lahko pričakujemo, da bo SNR analiza izjemno uporabna pri izbiri načinov sestave vezij kot tudi za selekcijo najprimernejših naprav za sestavo vezij. Da začnemo iskati najprimernejše naprave za sestavljanje vezij moramo prvo imeti na voljo knjižnico okarakteriziranih naprav in vedeti kakšne pogoje mora vezje izpolnjevati. Najprimernejše naprave ne smejo samo zadovoljiti pogojev za SNR izhodnega signala, ampak tudi doseči največji možni SNR.

Kvalitativni opis vezij

Zahtevna vezja (Difficult circuts)

So vezja v katerih posamezne naprave niso primerno usklajene, zato je zahtevno sestaviti delujoče vezje. Vezja je potrebno usklajevati postopoma, kar pogosto pomeni, da je potrebno veliko časa, da dosežemo željen nivo delovanja. Usklajevanje dodatno otežuje dejstvo, da že najmanjša motnja v vezju močno zniža SNR.

Plitva oz. majhna vezja (Shallow circuts)

So vezja, ki so sestavljena iz naprav, ki imajo široko območje nižjega SNR pogosto tik pod 0. Večina naprav se lahko primerno uskladi, tako da sestavljanje vezij ni zahtevno. Vendar se ločljivost signala zmanjšuje z vsako napravo, zato lahko izdelamo samo vzja, ki vsebujejo zelo omejeno število naprav.

Globoka oz. velika vezja (Deep circuts)

Sestavljajo jih naprave, ki imajo visoke SNR in so med seboj zelo dobro usklajene, zato se signal v takšnih vezjih lahko ohrani neglede na to koliko naprav sestavlja vezje. Edina omejitev za takšna vezja so načrtovanje vezja, vstavljanje vezja v celico in metabolna obremenitev vezja na celico.

Perspektivne skupine naprav za sestavljanje vezij =

Homologi tetraciklinskega represorja

Trenutno poznamo 20 homologov TetR, so zelo močni represorji, ki jih uspešno uporabljajo v različnih sistemih. Večina jih je že bila okarakteriziranih z input/output krivuljo, kar nam olajša nadaljne analize SNR. Vendar izmed vse 20 homologov so le štirje primerni za gradnjo večjih vezij in 5 do 10 jih je primernih za sestavljanje majhnih vezij.

Integrazna logika

Integrazna vrata, ki invertirajo določen odsek DNA, imajo input/output krivulje z zelo visokimi ojačitvami signala, ko prehajajo iz stanja visokega izhodnega signal v stanje nizkega izhodnega signala, kar bi moral dati visok ΔSNR. Vendar temu ni tako, vezja imajo pogosto nizke ΔSNR, saj v velike številu celic prehod med stanji ne poteče. Trenutno integrazna vrata nimajo primerno usklajenih nivojev vhodnih in izhodnih signalov, kot tudi, da trenutno ne poznamo veliko homologov.

TALE in represorji na osnovi cinkovega prsta

TALE so modularni DNA-vezavni proteini, ki se zelo specifično vežejo na določeno DNA zaporedje. Zaradi tega so zelo primerni za vlogo tako močnih promotorje kot močnih represorjev. Vendar trenutno večina TALE-nov nima primernih lastnosti, da bi bili primerni za izgradnjo vezij. Le nekatere bi lahko uporabili za majhna vezja, če želimo uporabljati TALE proteine v vezjih bi jim morali povečati sposobnost represije ali pa jim povečati kooperativnost tako, da bi izdelali fuzijske TALE proteine.

Represorji na osnovi cinkovega prsta so modularni DNA vezavni protein, ki jih podobno kot TALE proteine uporabljamo kot močne represorje. Vendar trenutno nimamo skoraj nobenih podatkov o njihovih input/output krivuljah in jih zato ne moremo uporabljati za izdelavo vezij. Vendar, ker je arhitektura njihovih promotorjev podobna arhitekturi od TALE proteinov, lahko predpostavimo, da bodo imeli podobne pomanjkljivosti.

Represorji na osnovi CRISPR

Represorji na osnovi CRISPR v prisotnosti vodilne RNA (guide RNA – gRNA) močno vežejo tarčno zaporedje DNA. Podobno kot TALE in cinkovi prsti izkazujejo lastnosti močnih represorjev, vendar lahko predvidevamo, da bo lažje razviti primerne CRISPR sisteme, saj razvijanje novih sistemov ne zahteva sprememb proteinskega zaporedja. Ker je CRISPR tehnologija zelo novo področje, še niso bile izveden potrebne raziskave, da bi jo uporabili za sestavljanje vezij.

Zaključek

Trenutno je sestavljanje bioloških vezij zelo zahtevo, saj nimamo na voljo knjižnice z okarakteriziranimi napravami, ki bi nam olajšali izbiro naprav za sestavo vezja. Zato je potrebno veliko časa, da posamezno vezje optimiziramo tako, da lahko doseže zahtevano učinkovitost. Zato bi nam analiza SNR močno olajšala izbiro primernih naprav za sestavo vezja kot tudi njegovo učinkovitost. Omogoči nam tudi optimizacijo naprav s iskanjem boljših homologov že uporabljenih naprav (npr. družina Tetraciklin represorjev), kot tudi sestavo primernih represorskih sistemov na osnovi TALE, cinkovega prst in represorjev na osnovi sistema CRISPR, hkrati nam omogoči preverjanja učinkovitosti perspektivnih sistemov kot so miRNA, aptameri, RNA-vezavni proteini, riboregulatorjev in protein-protein regulacija.

Viri

Beal J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2015;3:93. doi:10.3389/fbioe.2015.00093.