Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate

INŽENIRING BIOSINTEZNIH MEHANIZMOV ZA RAZNOLIKE POLIHIRDOKSIALKANOATE

UVOD

Polihidroksialkanoati (PHA) vzbujajo posebno pozornost kot trajnostna »zelena plastika« z realno možnostjo, da nadomestijo svoje tekmece, ki temeljijo na nafti. Za dosego tega cilja morajo biti PHA sposobni tekmovati tako z mehanskimi lastnostmi kot z ekonomskimi vidiki z uveljavljenimi plastikami. PHA ima značilno unikatno kombinacijo biorazgradljivosti, biokompatibilnosti, termične in mehanske lastnosti, kot tudi raznoliko molekularno maso. Te lastnosti zavisijo od same strukture PHA. Pestrost PHA je povečana s funkcionalnimi in cepljenimi PHA, naključnimi in blok kopolimeri in tiopoliestri. Povečanje PHA raznolikosti omogoča inženiring 3 osnovnih metabolnih poti: acetil-CoA pot, β-oksidacija in in situ sinteza maščobnih kislin in tudi spreminjanje specifičnosti PHA sintaze.

INŽENIRING BAKTERIJSKIH PHA SINTEZNIH MEHANIZMOV

PHA sintezne poti potrebujejo dodatek substratov, ki so strukturno sorodni monomerom PHA, predvsem v obliki maščobnih kislin in alkohola. Ti substrati so izredno dragi, zato so ustvarili poti, ki uporabljajo sladkorje kot relativno poceni substrat. Z uporabo spektra mikroorganizmov, ustvarjanjem novih poti in povišanjem učinkovitosti pretvorbe so izboljšali lastnosti PHA, naredili PHA sintezo bolj ekonomsko in uvedli poti za povsem nove PHA. V Ralstonii eutropha so le iz glukoze po inženirski metabolni poti acetil-CoA sintetizirali številne PHB kopolimere: PHBLA, P3HP3HB, P3HB4HB in PHBHHx. Za sintezo P3HP pa so poleg glukoze uporabili tudi glicerol. Omejevanje β-oksidacije maščobnih kislin v Pseudomonas putidi vodi v boljši maščobnokislinski pretok za sintezo številnih srednje dolgih verig PHA (mcl PHA). Sev je bil v prisotnosti heksanoata, heptanoata in okatanoata sposoben sintetizirat mcl PHA homopolimere: PHHx in PHHp. Z zamenjavo genov mcl PHA sintaze, phaC1 in phaC2, z geni, ki kodirajo manj specifične PHA sintaze iz Aeromonas hydrophila 4AK4 je P. putida kopičila homopolimer PHV, če so rasle na valeratu. Nato so to manj specifično PHA sintazo zamenjali s scl PHA sintazo iz Ralstonie eutrophe. Le-ta je sintetizirala homopolimere PHB in P4HB, ko je bakterija rastla v prisotnosti butirata ali β-butirolaktona. Iz tega sledi, da inženiring β-oksidacije omogoča nastanek PHA z definirano strukturo kot so homopolimeri, naključni ali blok kopolimeri in funkcionalni polimeri. Pot in situ sinteza maščobnih kislin omogoča sintezo PHA monomerov različnih dolžin iz sladkorjev. Na primer Pseudomonas putida KT2440 je sposobna sinteze mcl PHA medtem ko raste na nesorodnih ogljikovih virih kot je glukoza. To odpira možnosti uporabe poceni surovin za sintezo mcl PHA polimerov.

KLJUČNI ENCIM: PHA SINTAZA DOLOČA RAZNOLIKOST PHA

Najbolj znane PHA sintaze so scl in mcl PHA sintaze. Zelo malo pa je sintaz, ki so sposobne kopolimerizirat oba PHA monomera, tako scl in mcl. To so nizko specifične PHA sintaze. Nizko specifični sintazi sta PhaC61-3 in PhaC21317 in izvirata iz Pseudomonas spp. Za izboljšano sintezo različnih PHA v E. coli so PHA sintazo PhaC21317 kodonsko optimizirali. Njena mRNA je bila stabilizirana z uporabo zanke, kar je vodilo v stabilen transkript in povišano ekspresijo PhaC21317. Ta optimizirana PhaC21317 je povečala PHB produkcijo za 16-krat v primerjavi z divjim tipom. Če je E. coli rasla na dodekanoatu je kopolimerizirala 4x več PHA, iz 3HB in mcl 3HA monomerov, v primerjavi s kontrolo. Rezultati kažejo, da je strategija uspešna za povišanje ekspresije PHA sintaze in raznolikosti PHA.

SISTEMSKO-BIOLOŠKI PRISTOPI

Za izboljšenje sevov se uporabljajo tudi sistemsko-biološki pristopi. Za PHA biosintezo so uporabili in silico metabolno modeliranje s katerim so za 100% izboljšali titer PHA v sevu P. putida. Z uporabo in silico metabolnih modelov so naredili dvojni knockout (Δgcd-aco) seva P. putida KT2440 . Sev je dosegel dvakrat višjo koncentracijo mcl PHA v primerjavi z divjim tipom in višjo za 21% v primerjavi s sevom z enim knockout (Δgcd). Ti rezultati sugerirajo, da lahko z uporabo sistemske biologije in metabolnega modeliranja v prihodnje dosežemo raznolike PHA.

INŽENIRING BAKTERIJSKE PHA SINTEZE Z UPORABO CRISPR

CRISPR sistem je moč uporabiti za nadzorovanje PHA biosintezne poti in za prilagajanje sestave PHA. V sevu E. coli so naredili pot za sintezo PH3HB4HB iz glukoze, v katero je vključen tudi cikel citronske kisline. Z uporabo petih specifičnih sgRNA so preusmerili pretok ogljika v biosintezo 4HB, kar je omogočilo nastanek PH3HB4HB. S CRISPR sistemom so negativno regulirali gene sdhA, sdhB, sucC, sucD in sad. Nastali PH3HB4HB je vseboval 1-9 mol% 4HB. Vsebnost 4HB v P3HB4HB je mogoče prilagoditi od 1,4 do 1,8 mol %, odvisno od ekspresijskega nivoja genov. Rezultati kažejo, da je CHRISPR izvedljiv pristop hkratne manipulacije številnih genov in nadzora metabolnega pretoka v E. coli.

SINTEZNA BIOLOGIJA IN RAZNOLIKOST PHA

To je sigurno področje v kateri bo sintezna biologija lahko prinesla izredno zmanjšanje stroškov. Le-ta omogoča načrtovanje in sestavljanje novih poti za sintezo uporabnih PHA iz poceni in nesorodnih virov ogljika. Sintezna biologija je našla vlogo tudi v konstrukciji novih robustnih industrijskih sevov, Halomonas spp., ki omogoča učinkovito kontinuirano in odprto sintezo PHA. Tudi v zaključnem postopku je lahko vključena, npr. z poenostavljenimi celičnimi separacijami, kar lahko še dodatno zmanjša stroške proizvodnje.

ZAKLJUČEK

Raznolikost PHA lahko dosežemo s spreminjanjem specifičnosti PHA sintaz, kot tudi z metabolnim inžiniringom poti, ki sodelujejo pri sintezi PHA. Z razvojem metode urejanje genoma in ostalih pristopov molekularne biologije lahko sintetiziramo PHA z želenimi monomeri in s tem prilagodimo PHA razgradljivost, biokompatibilnost ter termične in mehanske lastnosti. Hkrati pa lahko izboljšamo tudi ekonomski vidik proizvodnje PHA.

VIRI

Chen G.-Q., Hajnal I., Wu H, Lv L. in Ye J. Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversfying Polyhydroxyalkanoates. Trends in Biotechnology, 2015, 33, 10,565-574.

Lv L., Ren Y.-L., Chen J.-C., Wu Q., Chen G.-Q. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis. Metabolic Engineering, 2015, 29, 160-168.

Borrero-de Acuna J. M., Bielecka A., Haussler S., Schobert M., Jahn M., Wittmann C., Jahn D. in Poblete-Castro I. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoate in metabolic flux optimized Pseudomonas putida. Microbial Cell Factories, 20014, 13.