Uporaba sintezne biologije v terapevtske namene

Uvod

Evkariontske celice v večceličnih organizmih so sposobne zaznavati in shraniti pomembne fiziološke in biološke informacije o stanju organizma in se nanje tudi odzivati. Razvile so se kompleksne signalne poti, ki celicam omogočajo normalno funkcijo in medsebojno komunikacijo, kar pa je ključno za pravilno delovanje celotnega organizma. Kot posledica genetske okvare katere od signalnih poti lahko pride do nastanka različnih hudih motenj, kot so metabolne ali imunske bolezni in rak. Konvencionalna zdravila za te bolezni so pogosto neučinkovita, zato se vedno bolj razvija področje celične in genske terapije, s katero lahko povrnemo funkcijo obolelim ali poškodovanim celicam, tako da v organizem na tarčno mesto vnesemo zdrave celice oz. pravilno delujoče gene in tako neposredno odpravimo vzrok bolezni [1, 2].

IZGRADNJA BIOLOŠKIH SISTEMOV

Sintezna biologija nam omogoča združimevanje bioloških komponent iz različnih organizmov in tako ustvarjanje »umetnih« bioloških poti, ki jih lahko natančno reguliramo na različnih nivojih. Za pripravo takšnih bioloških sistemov pa lahko uporabimo samo dobro okarakterizirane biološke komponente [1].

KONTROLA NA NIVOJU TRANSKRIPCIJE

Naravne bakterijske transkripcijske faktorje (TF), kot so LacI, TetR, GAL4, lahko spremenimo v regulatorje izražanja genov v evkariontskih celicah, če pripravimo fuzijo teh proteinov z regulatornimi domenami nekaterih drugih proteinov [1, 2]. Fuzija proteina LacI z aktivatorsko domeno VP16 iz virusa herpes simplex lahko aktivira transkripcijo gena iz sinteznega evkariontskega promotorja z ustreznim operatorskim zaporedjem. Če pa pripravimo fuzijo LacI z represorsko domeno KRAB, lahko blokiramo transkripcijo gena. Prav tako lahko z dodatkom majhnih molekul enostavno reguliramo vezavo transkripcijskega faktorja na DNA (IPTG, doksiciklin) [1, 2]. V zadnjih letih so prokariontske TF zamenjale fuzije regulatornih domen z DNA-vezavnimi proteini s cinkovimi prsti, proteini TALE in neaktivno obliko Cas9 (sistem CRISPR/Cas9), ki pa niso omejeni na vezavo točno določenega zaporedja DNA, ampak jih lahko pripravimo tako, da vežejo praktično katero koli zaporedje. Vse to pa omogoča učinkovito aktivacijo ali represijo tarčnih genov, ki so udeleženi v neki metabolni poti pri kvasovkah, kar pa bi se lahko izkazalo za uspešno tudi pri popravljanju okvarjenih metabolnih poti pri sesalcih in s tem pri zdravljenju raznih bolezni [1, 2].

KONTROLA NA NIVOJU TRANSLACIJE

Izražanje sinteznega genetskega vezja lahko zelo natančno uravnavamo z uporabo regulatorjev, ki temeljijo na RNA, kot so miRNA in RNA aptameri (ribocimi) [1, 2]. Regulacija z miRNA ima pomembno vlogo pri embrionalnem razvoju in ohranjanju tkivne specifičnosti genov, kar so znanstveniki s pridom izkoristili za zmanjšanje »off-target« efektov pri genski terapiji. Gre za to, da so v 3'-neprevedljivo regijo transgena vnesli prepoznavno zaporedje za eno ali več miRNA. V tipih celic, ki sintetizirajo ustezno miRNA, bo torej tak transgen utišan, kar je še posebej pomembno za zmanjšanje imunogenosti terapije (npr. zaradi utišanja gena v antigen-predstavitvenih celicah) [1, 2]. Poleg tega pa so znanstveniki na podoben način ustvarili tudi ribocime, ki omogočajo uravnavaje izražanja transgena ob točno določenem času, glede na stanje celice. Pripravili so RNA aptamere (so del ribocima), ki vežejo majhne molekule, metabolite ali proteine. Po vezavi liganda na aptamer postane ribocim katalitično aktiven, cepi »samega sebe« in tako pride do utišanja gena [1, 2].

CELIČNA SIGNALIZACIJA IN KONTROLA NA POSTTRANSLACIJSKEM NIVOJU

Kontrola izražanja genov, ki temelji na sinteznih transkripcijskih faktorjih, je omejena na relativno malo molekul, ki so sposobne regulirati ta proces. Sesalske celice pa imajo na svoji površini ogromno različnih receptorjev, ki po vezavi endogenih ali eksogenih ligandov sprožijo najrazličnejše odgovore v celici [1, 2]. Eden od takšnih primerov so z G-proteini sklopljeni receptorji (GPCR), ki prenašajo ekstracelularni signal v notranjost in v celici sprožijo različne odzive. Podrobne raziskave njihove strukture in funkcije so znanstvenikom omogočile razvoj podobnih receptorjev, ki se odzivajo na sintetične ligande. Imenujejo se receptorji, aktivirani izključno s sintetičnimi ligandi (angl. receptors activated solely by synthetic ligands, RASSL). Gre za spremenjene endogene GPCR-je, ki imajo modificiran vezavni žep za ligand. Izkazalo se je, da so sintetični ligandi aktivirali tudi nekatere GPCR-je divjega tipa. Kasneje so uspeli pripraviti nove, boljše receptorje, imenovane DREADD (angl. designer receptor exclusively activated by designer drugs), katerih ligandi pa ne interagirajo z endogenimi GPCR-ji. Prvi tak receptor je bil človeški muskarinski receptor za acetilholin M3, ki se odziva na sicer inertno molekulo klozapin-N-oksid (antipsihotik). Kasneje so razvili še veliko DREADD-ov, ki imajo pomembno vlogo pri sestavljanju ortogonalnih sinteznih vezij in jih lahko uporabljamo za pripravo umetnih signalnih poti, saj lahko z uporabo ustreznega liganda aktiviramo želeno signalno pot v celici [1, 2]. Stabilnost proteinov pa lahko reguliramo tudi preko njihove razgradnje, in sicer s t.i. z ligandom inducirano razgradnjo (angl. ligand-induced degradation, LID) proteinov. Gre za to, da pripravimo fuzijo želenega proteina z domeno LID, ki ima vezavno mesto za nek ligand, v prisotnosti katerega pride do hitre razgradnje proteina, v odsotnosti ostane le-ta stabilen. Na podoben način lahko pripravimo protein, ki je v prisotnosti liganda bolj stabilen, v odsotnosti pa se razgradi [1, 2].

TERAPEVTSKE CELICE

Sesalske celice, ki lahko zaznajo različne dražljaje, informacije obdelajo in nato sprožijo želen odziv, bi lahko uporabili kot »naprave« za diagnosticiranje različnih bolezni preko zaznavanja raznih biomarkerjev, za odkrivanje novih zdravil in celo kot teranostične naprave. Dokazali so že, da lahko z implantacijo takšnih celic uspešno ozdravijo bolezni, kot so diabetes in debelost pri miših. Poleg tega pa so ugotovili, da so gensko spremenjene T-celice, pripravljene ex vivo, sposobne prepoznati in uničiti raka pri človeku. Konvencionalna terapija temelji na ločeni diagnostiki in zdravljenju teh bolezni, implantacija teranostičnih celic pa omogoča združevanje obojega hkrati [1, 2, 3].

TERANOSTIČNI CELIČNI IMPLANTATI ZA ZDRAVLJENJE DIABETESA

Diabetes je kompleksna bolezen, pri kateri pride do kroničnega povišanja koncentracije glukoze v krvi zaradi propada β-celic pankreasa (tip I) ali zmanjšanja občutljivosti celic na inzulin (tip II). V poznih fazah diabetesa tipa I pride v jetrih tudi do povečane sinteze ketonskih telesc kot alternativnega vira energije, kar poruši kislinsko-bazično ravnotežje v krvi in povzroči akutno diabetično ketoacidozo, ki je lahko smrtna. Znanstveniki so razvili teranostično genetsko vezje, ki sproži proizvodnjo inzulina ob znižanju pH. Uporabili so z G-proteinom sklopljen receptor TDAG8, ki se izraža konstitutivno, in zazna povečano ekstracelularno koncentracijo protonov, kar v celici sproži aktivacijo adenilat ciklaze, ki ATP pretvarja v cAMP. Slednji aktivira protein kinazo A (PKA), ki se prenese v jedro, kjer fosforilira in aktivira transkripcijski faktor CREB1. V genetsko vezje so vključili tudi sintezni promotor PCRE, na katerega se veže CREB1 in aktivira transkripcijo transgena (inzulina) [3, 4].

TERANOSTIČNI CELIČNI IMPLANTATI ZA ZDRAVLJENJE DEBELOSTI

V zadnjem času se je izkazalo, da lahko teranostične celične implantate uporabimo tudi za uravnavanje razmerja med vnosom in porabo energije in s tem za preprečevanje debelosti. Znanstveniki so razvili genetsko vezje, ki konstantno regulira nivo maščobnih kislin v krvi. Pripravili so sintezni intracelularni receptor, ki zaznava lipide (angl. lipid-sensing receptor, LSR). Gre za fuzijo vezavne domene za ligand iz α-receptorja, aktiviranega s proliferatorjem peroksisomov oz. PPARα (katerega ligandi so maščobne kisline), z bakterijskim DNA-vezavnim proteinom TtgR, ki se izraža konstitutivno. Kompleks se veže na operator OttgR, ki je povezan z minimalnim promotorjem PhCMRmin. V odsotnosti maščobnih kislin, se na LSR vežejo endogeni inhibitorji transkripcije. Transkripcija transgena se aktivira v prisotnosti maščobnih kislin, ko pride do vezave endogenih aktivatorjev na LSR. Kot transgen so uporabili peptidni hormon pramlintin, ki zavre apetit, poveča občutek sitosti in upočasnjuje praznjenje črevesja. Napravo so vstavili v trebušno votlino miši, pri katerih so opazili občutno zmanjšanje telesne teže tudi pri tistih miših, ki so uživale hrano, zelo bogato z maščobami [3,5].

TERANOSTIČNE T-CELICE, KI PREPOZNAJO IN UNIČIJO RAKA

Zelo uporabne za zdravljenje raka so lahko T-celice, saj so že naravno sposobne prepoznati okužene, poškodovane in nepravilno delujoče celice glede na antigene, ki jih imajo le-te na površini. V te namene so razvili himerne receptorje antigenov (angl. chimeric antigen receptor, CAR), to so sintezni T-celični receptorji, usmerjeni proti točno določenemu antigenu. So modularni fuzijski proteini, zgrajeni iz citoplazemskega dela T-celičnega receptorja (CD3ζ), transmembranske regije koreceptorja CD8 in ekstracelularnega enoverižnega fragmenta variabilnih regij protiteles (scFv), ki prepoznajo specifični antigen na površini rakavih celic. Druga in tretja generacija CAR ima še dodatne kostimulatorne domene. Po vezavi antigena na receptor, se v T-celici aktivira ZAP70/PLCγ signalna pot, ki sproži proliferacijo in sproščanje citotoksičnih snovi, ki pobijejo rakave celice. Terapije s tehnologijo CAR, ki so trenutno v kliničnih raziskavah, kažejo zelo dobre rezultate, vendar pogosto prihaja do toksičnih »on-target off-tumour« efektov zaradi prenizke specifičnosti. Za povečanje specifičnosti so razvili logična vrata IN, ki vključujejo izražanje dveh različnih CAR in zahtevajo hkratno izražanje dveh antigenov na tarčni celici, sicer jih T-celica ne uniči. T-celice, ki izražajo CAR, pripravimo ex vivo [1,3].

DOSTAVA TERAPEVTIKOV ZA CELIČNO IN GENSKO ZDRAVLJENJE

Znanstveniki so sposobni pripraviti vedno boljše sisteme za gensko in celično zdravljenje, vendar je dejanska uporaba na ljudeh omejena zaradi neučinkovite dostave takšnih zdravil na tarčna mesta. Za stabilno in dolgotrajno izražanje želenega gena se uporabljajo virusni vektorji, kot so retrovirusi, adenovirusi in z adenovirusi povezani virusi, vendar se pogosto pojavljajo problemi z imunogenostjo in “off-target” efekti. Da se izognemo imunskemu odzivu, lahko pripravimo enkapsulirane celice, kar pomeni, da jih obdamo s polprepustno membrano iz polietilen glikola ali alginata, preko katere lahko prehajajo hranila in kisik, večje molekule in celice imunskega sistema pa ne [1]. Da bosta genska in celična terapija dejansko prišle v širšo uporabo je potrebno razviti predvsem boljše dostavne sisteme, ki bodo omogočali varno uporabo tovrstnih zdravil.

Viri:

1. Haellman, V., Fussenegger, M., Synthetic biology – toward therapeutic solutions, Journal of Molecular Biology (2015), doi: 10.1016/j.jmb.2015.08.020

2. Lienert, F., Lohmueller, J.J., Garg, A., Silver, P.A., Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics (2014), Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107

3. Ye, H., Fussenegger, M., Synthetic terapeutic gene circuits in mammalian cells (2014), FEBS Letters, 588(15): 2537-2544

4. Ausländer, D., Ausländer, S., Charpin-El Hamri, G., Sedlmayer, F., Müller, M, Frey, O., Hierlemann, A., Stelling, J, Fussenegger, M., A synthetic multifunctional mammalian pH sensor and CO2 transgene-control device (2014), Molecular Cell 55(3): 397-408

5. Rössger, K., Charpin El-Hamri, G., Fussenegger, M., A closed-loop synthetic gene circuit for the treatment of diet-induced obesity in mice (2013), Nature Communications 4, doi: 10.1038/ncomm3825