"Training protein" - PETaze

iGEM 2016 - Team: TJUSLS China [1]

Skupina TJUSLS China iz Kitajske je predlagala nov model v encimologiji imenovan »Training Protein«, ki je primeren za vse encime. Gre za tarčno spreminjanje encima glede na njegove značilnosti. Delo poteka v dveh stopnjah. Sprva morajo raziskovalci analizirati terciarno strukturo proteina in jo tudi razumeti za nadaljnje delo. Druga stopnja vsebuje dve različni poti, in sicer direktno mutacijo in predstavitev na površini. Glede na analizo terciarne strukture proteina in določene funkcionalne domene, se izbere mesto za uvedbo direktne mutacije. S predstavitvijo na površini se lahko izboljša katalitična učinkovitost encima, poleg tega se s tem tudi izognemo morebitnim težavam čiščenja proteina.

PET in PETaze

[1] Polietilen tereftalat, okrajšano PET, je poliester, ki nastane s kondenzacijsko polimerizacijo tereftalne kisline in etilen glikola. Pri dimerizaciji omenjenih dveh molekul, osnovnih gradnikov za nastanek PET, nastaja voda kot stranski produkt. Nato se povezava monomerov in dimerov nadaljuje vse dokler ne nastane dolg polimer. PET se uporablja predvsem za izdelavo plastenk in drugih embalaž v prehrambni, farmacevtski in kozmetični industriji. Prav tako je prisoten tudi v tekstilni industriji, izdelavi električno izolacijskih materialov, kaset in drugih izdelkov. Cela vrsta pozitivnih lastnosti tega poliestra je razlog za razširjeno uporabo po celem svetu. Posledično imamo tudi veliko odpadnega PET, ki predstavlja velik okoljski problem, saj onesnažuje okolje. Zato je potrebno najti optimalen način odstranjevanja PET. Lahko se ga reciklira s procesi rezanja, segrevanja, taljenja. Tak način je poceni, vendar ni optimalen. Izkazalo se je, da je biodegradacija najboljši način razgradnje plastike. Pri tem se uporabijo mikroorganizmi, kot so bakterije in glive, ki so sposobni zelo učinkovito in navsezadnje tudi poceni razgraditi določen material.

PET hidrolaze, okrajšano PETaze, so encimi, ki so jih našli v neki vrsti mikroorganizmov, ki živijo na polietilen tereftalatu in ga uporabljajo kot glavni vir ogljika. Glavna funkcija PETaz je razgradnja makromolekulskih polimerov polietilen tereftalata do monomerov.

Struktura in mutacije PETaze

[2-5] Glive vsebujejo nekaj različnih encimov sposobnih razgradnje PET, kot so na primer LCC, TfH in FsC. Vendar so ti encimi občutno manj aktivni pri nižjih temperaturah, temperaturah v območju od 20 °C do 40 °C, kot encim PETaza, ki je edini bakterijski encim sposoben razgradnje PET. Torej so reakcijski pogoji PETaz najprimernejši za praktično uporabo skupine encimov, ki razgrajujejo PET. Druga prednost PETaz je sposobnost razgradnje visoko kristaliziranega PET, ki je del plastenk, medtem ko je aktivnost sorodnih encimov več kot 20x nižja od aktivnosti PETaz. Raziskovalna skupina se je odločila izboljšati aktivnost encima PETaze, in sicer z uporabo mestno specifične mutageneze. Znano je, da na funkcijo proteina v veliki meri vpliva sama terciarna struktura. Zato so najprej z X-ray difrakcijsko tehniko in kristalografijo proteinov določili terciarno strukturo encima, našli katalitični center, center encima s katerim so ugotovili mehanizem delovanja encima in glede na to izbrali mesto za uvedbo mutacije.

Glede na homolognost PETaz z drugimi encimi in že znano literaturo, so se odločili, da bodo izvedli tri mestnospecifične mutacije, in sicer na aminokislinskih ostankih na mestih 64, 181 in 212. Znanstvenik Ren Wei je na encimu TfCut2 izvedel mutacijo aminokislinskega ostanka treonina na mestu 63 in ugotovil, da je produkt razgradnje inhibiral reakcijo. Zaradi visoke homolognosti aminokislinskega zaporedja TfCut2 in PETaz so se odločili, da bodo izvedli mutacijo arginina v treonin na 64-em aminokislinskem ostanku PETaze. S to mutacijo so želeli zmanjšati inhibicijo encima s strani produkta. Znanstvenik Kengo Kitadokoro je ugotovil, da je treonin na mestu 216 encima Est119 povezan z nastankom hidrofobnega žepa. Zaporedje, ki tvori hidrofobni žep, je homologno zaporedju PETaze. Glede na to so se odločili izvesti mutacijo PETaze na mestu 181, in sicer so aminokislinski ostanek serina mutirali v treonin. S tem so želeli povečati nepolarnost encima, regijo za vezavo nepolarnega substrata pri reakciji, torej makromolekulskega polimera PET. Na encimu Est119 so ugotovili, da je fenilalanin na mestu 248 ključen za fleksibilno vezavo encima na različno dolge ogljikove verige in da je tudi to zaporedje homologno z zaporedjem PETaz. Zato so se odločili za izvedbo tretje mutacije PETaze in sicer na mestu 212. Da bi povečali hidrofobni žep, so mutirali polarni aminokislinski ostanek - serin v nepolarni aminokislinski ostanek - fenilalanin.

Predstavitev na površini

[6-13]

Prednosti predstavitve na površini

Predstavitev na površini je metoda, s katero želimo na površini gostiteljske celične stene predstaviti tarčni protein. To naredimo tako, da izvedemo celotno celično katalizo s fuzijo gena, ki kodira tarčni protein/polipeptid, z genom, ki kodira sidrni protein. Pri tem so pomembne tudi posttranslacijske spremembe in zvijanje fuzijskega proteina. Na nek način tarčni protein, v našem primeru encim PETazo, imobiliziramo na površini celice. S tem encimu povečamo stabilnost, ga lažje kontroliramo, obnovimo za ponovno delovanje, omogočimo ponovno uporabo ter navsezadnje je tak način uporabe encimov cenejši.

Možnosti ekspresijskega sistema fuzijskega proteina

Za izražanje rekombinantnih proteinov na splošno ločimo prokariontske in evkariontske ekspresijske sisteme, le-ti se razlikujejo po svojih prednostih in slabostih. Skupina iz Kitajske se je odločila primerjati izražanje PETaz v dveh različnih ekspresijskih sistemih. Izvedli so predstavitev na površini bakterije Escherichia coli, kot predstavnika prokariontov, in na površini kvasovke Pichia pastoris, kot predstavniku evkariontov. Za E. coli so se odločili zaradi hitre delitve izbrane bakterije, dobro poznanega genetskega ozadja, saj je E. coli ena izmed najbolj široko uporabljenih prokariontov, in seveda tudi zaradi cenovne ugodnosti. Med evkarionti so se odločili za metilotrofno kvasovko P. Pastoris, ki je zmožna rasti in učinkovito izražati proteine z uporabo metanola, kot edinega vira ogljika. V metabolni poti metanola P. pastoris imamo prisoten promotor za alkoholno oksidazo (AOX1), ki je eden izmed najmočnejših evkariontskih promotorjev. Izražanje rekombinantnega proteina s promotorjem AOX1 omogoča velik izkoristek izražanja, torej veliko količino želenega produkta - od 20 g/l do 30 g/l. V primerjavi z E. coli je dodatna prednost P. pastoris tudi večja stabilnost in manjša stopnja mutacij izraženega proteina. Zaradi večje stabilnosti izražanja in ohranjanja encimske aktivnosti so gen za PETazo vstavili v genom kvasovke.

Izbira sidrnega zaporedja

Z različnimi analizami so glede na veliko različnih faktorjev in izbiro optimalnih pogojev izbrali štiri sidrna zaporedja za izražanje v E. coli BL21; in sicer INPN, Lpp-OmpA, BrkA in AIDA, in tri različna sidrna zaporedja za izražanje v P. pastoris GS115; in sicer GCW51, GCW21 in GCW61.

Fuzijska sekrecija hidrofobina in PETaze ter njuna hkratna predstavitev na površini

[14] Celična površina kvasovk je hidrofilna, PET pa je hidrofoben. Fuzija PETaze in hidrofobina omogoča, da lahko PETaza, ki je izražena na površini kvasovke, interagira s PET in ga tudi razgradi. Za to, na začetku ne logično interakcijo, je zaslužen amfifilen protein hidrofobin, ki ga izražajo filamentozne glive. S svojo vezavo je sposoben spremeniti hidrofobno površino v hidrofilno in obratno. Hidrofobin se spontano veže na hidrofilno celično površino kvasovk in potem ostane hidrofobni del na zunajcelični strani in tako s hidrofobnimi interakcijami pritegne površino PET, se nanj adsorbira ter posledično omogoči delovanje PETaz. Veliko izboljšanje encimske aktivnosti in razširitev reakcijskih pogojev delovanja encima je omogočila hkratna predstavitev PETaze in hidrofobina na površini evkariontskih celic prav zaradi posebnih lastnosti hidrofobina, kot so amfifilnost, odpornost na visoko temperaturo, kisline in baze.

Kratek povzetek

S pomočjo kristalografije proteinov in X-ray difrakcijske tehnike je skupina iz Kitajske našla katalitični center encima PETaze in njegovo vezavno mesto. Glede na analize so izbrali ustrezno mesto za mutacije ter izvedli direktno mutacijo z namenom, da bi izboljšali učinkovitost razgradnje in termično stabilnost. Za celotno celično katalizo so uporabili predstavitev na površini prokariontov (Escherichia coli) in evkariontov (Pichia pastoris). Fuzijski protein, ki se je po fuziji PETaze in hidrofobnega proteina izražal v P. pastoris, je prevzel prednost hidrofobnosti hidrofobnega proteina, ki mu je za boljšo učinkovitost razgradnje omogočala hidrofobno okolje. Izražanje omenjenega fuzijskega proteina v P. pastoris je povzročilo spremembe lastnosti celične površine tako, da so se bile celice sposobne prilagoditi ekstremnim okoljskim pogojem. Posledično so celotni celični biokatalizi povečali katalitično učinkovitost in ji omogočili, da ni imela strogih omejitev glede reakcijskih pogojev. To pomeni tudi veliko prednost za uporabo PETaz za industrijske namene razgradnje PET.

Dodatna literatura poleg članka iGEM ekipe TJUSLS China 2016

1. URL: http://discovery.kcpc.usyd.edu.au/9.2.2/9.2.2_PET.html (24.11.2016) 2. Yoshida S, Hiraga K, Takehana T, et al. A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate).[J]. Science, 2016, 351(6278):1196-1199. 3. Kitadokoro, Kengo, Thumarat et al.(2012). Crystal structure of cutinase Est119 from Thermobifida alba AHK119 that can degrade modified polyethylene terephthalate at 1.76Å resolution. Polymer Degradation and Stability, 97(5), 771-775. doi: 10.1016/j.polymdegradstab.2012.02.003 4. Roth, C., Wei, R., Oeser, T. et al. (2014). Structural and functional studies on a thermostable polyethylene terephthalate degrading hydrolase from Thermobifida fusca. Appl Microbiol Biotechnol, 98(18), 7815-7823. doi: 10.1007/s00253-014-5672-0 5. Wei, R., Oeser, T., Schmidt, J. et al. (2016). Engineered bacterial polyester hydrolases efficiently degrade polyethylene terephthalate due to relieved product inhibition. Biotechnol Bioeng, 113(8), 1658-1665. doi: 10.1002/bit.25941 6. Rutherford, Nancy,Mourez, Michael: Surface display of proteins by Gram-negative bacterial autotransporters. MICROBIAL CELL FACTORIES ,2006 5(22) 7. Jarmander, Johan; Gustavsson, Martin; Thi-Huyen Do: A dual tag system for facilitated detection of surface expressed proteins in Escherichia coli. MICROBIAL CELL FACTORIES,2012 11(118) 8. Karami, Ali; Latifi, Ali Mohamad; Khodi, Samaneh: Comparison of the Organophosphorus Hydrolase Surface Display Using InaVN and Lpp-OmpA Systems in Escherichia coli. JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,2014 24(3) 379-385 9. Li, L; Kang, DG; Cha, HJ: Functional display of foreign protein on surface of Escherichia coli using N-terminal domain of ice nucleation protein. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2004 85(2) 214-221 10. Zhai Y, Zhang K, Huo Y, Zhu Y, Zhou Q, Lu J, Black I, Pang X, Roszak AW, Zhang X et al (2011) Autotransporter passenger domain secretion requires a hydrophobic cavity at the extracellular entrance of the betadomain pore. Biochem J 435:577–587 11. Dautin N, Barnard TJ, Anderson DE, Bernstein HD (2007) Cleavage of a bacterial autotransporter by an evolutionarily convergent autocatalytic mechanism. EMBO J 26:1942–1952 12. Fang S, Pang X, Tian X, et al. BrkAutoDisplay: functional display of multiple exogenous proteins on the surface of Escherichia coli, by using BrkA autotransporter[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 14(1):1-12. 13. DongHeng Guo, YanShan Xu, YaJun Kang et al (2016). Synthesis of octyl-β- d -glucopyranoside catalyzed by Thai rosewood β-glucosidase - displaying Pichia pastoris, in an aqueous/organic two-phase system[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2016, 85:90–97. 14. Pan W, Jie H, Sun Y, et al. Display of fungal hydrophobin on the Pichia pastoris cell surface and its influence on Candida antarctica lipase B[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2016:1-13.