BeeT Beehave
iGEM Team: Wageningen UR – BeeT Beehave
http://2016.igem.org/Team:Wageningen_UR
UVOD
Čebele so pomembni prebivalci našega okolja, saj z nabiranjem cvetnega prahu oprašujejo rastline in pridelujejo med. Močno pa jih lahko prizadene okužba s parazitom Varroa Destructor. Čeprav je danes razvitih že precej metod, s katerimi se proti parazitu lahko borimo, pa nobena ni popolnoma učinkovita in varna. Skupina podiplomskih študentov iz Univerzitetnega in raziskovalnega centra Wageningen na Nizozemskem je v okviru iGEM tekmovanja načrtovala nov način za boj proti čebeljemu parazitu Varroa Destructor. Pripravili so gensko spremenjene bakterije, ki so se sposobne odzivati na prisotnost parazitov in sintetizirati toksin, ki je za parazite usoden. Sistem je učinkovit, varen in enostaven za uporabo. Pripravili so ga v obliki majhnega kontejnerja, ki bi ga dali v sladkano vodo, ki jo čebele uporabljajo za hranjenje svojih ličink. Bakterije bi detektirale prisotnost parazita Varroa Destructor in začele proizvajati toksin, ki bi parazita uničil in omogočil normalen razvoj ličinke v zdravo odraslo čebelo.
VARROA DESTRUCTOR
Varroa destructor (po slovensko Varoja) je parazit, ki z okužbo močno prizadene čebele. Samica parazita vstopi v satovje, kjer se nahajajo čebelje ličinke in tam izleže jajčeca. Odrasli paraziti nato skupaj s čebelo zapustijo satovje in se razširijo še na ostale čebele znotraj panja. Paraziti čebeli sesajo kri, poleg tega pa prenašajo tudi nekatere bolezni in viruse. Ker se čebele same niso sposobne boriti proti parazitu, jih taka okužba močno prizadene. Danes poznamo kar nekaj metod za odstranjevanje parazitov, vendar pa nobena od teh ni popolnoma učinkovita in varna. Takšna sredstva na eni strani škodujejo čebelam, na drugi pa kontaminirajo med, kar posredno lahko škoduje tudi človeku. Obstoječe metode bistveno zmanjšajo okuženost čebel, ne morejo pa je popolnoma preprečiti.
PROJEKT
BeeT
Skupina je razvila način s katerim se lahko učinkovito borimo proti parazitu Varroa Destructor. Pripravili so gensko spremenjene bakterije E.coli, ki specifično in kontrolirano sproščajo toksin, ki je za parazite toksičen hkrati pa neškodljiv za čebele in človeka. Pri tem so se osredotočili na tri pomembna področja:
- Specifičnost sintetiziranega toksina,
- Kontrolirano sproščanje toksina,
- Preprečevanje razširjanja gensko spremenjenih bakterij v okolje.
Specifičnost
Pomembno je, da je specifičnost toksina, ki uničuje parazita Varroa Destructor, zelo visoka, saj se le tako lahko izognemo škodljivim učinkom na človeka, čebele in ostale organizme. Skupina je uporabila Bt toksin, ki ga proizvajajo bakterije Bacillus thuringiensis, za katerega je znano, da je visoko vrstno specifičen in se aktivira samo ob vezavi na točno določeno tarčo. Obstoječi Bt toksin so preoblikovali tako, da specifično interagira samo z receptorji epitelijskih celic v membrani prebavnega trakta parazita. Po vezavi na tak receptor toksin polimerizira in v membrani prebavnega trakta ustvari pore v obliki ionskih kanalčkov. Z metodo naključne mutageneze so pripravili več različnih variant Bt toksina in njihov učinek testirali z in vitro testom toksičnosti.
In vitro test toksičnosti
Iz parazita Varroa Destructor so izolirali epitelijske celice prebavil in iz njih pripravili vezikle, ki na membrani vsebujejo specifične receptorje, v notranjosti pa fluorofor 6-karboksifluorescein. Pripravljene vezikle so izpostavili različnim variantam Bt toksina (Cry3Aa), ki so jih pripravili z naključno mutagenezo. Za matrico so uporabili plazmid pSB1A3_Cry3Aa_TEV_HIS. Tista varianta toksina, ki je za parazita toksična, se specifično veže na receptor in povzročil nastanek pore v membrani vezikla. Posledica tega je sproščanje fluoroforja iz vezikla in porast fluorescence. Lastnost takega fluoroforja je, da znotraj vezikla, kjer je v visoki koncentraciji, tvori dimere in tako inhibira samega sebe. Ob sprostitvi iz vezikla pa se njegova koncentracija zniža, zato se fluorescenca močno poveča. Pri testu so merili spreminjanje intenzitete fluorescence s časom.
Regulacija
Znano je, da nizke koncentracije toksina za parazita Varroa Destructor niso usodne, poleg tega pa lahko vodijo v nastanek rezistence. Za uspešno uničenje parazita je zato potrebno zagotoviti, da se toksin sintetizira v dovolj visoki koncentraciji in samo ob prisotnosti parazita. Pripravljene bakterije zato vsebujejo dva sistema; prvega, ki detektira prisotnost parazita v bližini in drugega, ki omogoča komunikacijo med bakterijskimi celicami ter tako zagotavlja sintezo dovolj velike količine toksina.
Detekcija prisotnosti parazita Varroa Destructor
V bakterije so v ta namen vnesli dva riboswitch stikala; prvo, ki je občutljivo na vitamin B12 in drugo, ki je občutljivo na gvanin. Vitamin B12 se izloča iz ran, ki jih parazit povzroči pri sesanju čebelje krvi, gvanin pa je ena glavnih komponent parazitovih iztrebkov. Riboswitch stikala so mRNA domene, ki v odvisnosti od vezave liganda regulirajo izražanje genov. Izražanje gena za toksin v našem primeru je ob vezavi vitamina B12 ali gvanina inhibirano, zato so v konstrukt vključili štiridelni inverter. Konstrukt je sestavljen iz konstitutivnega promotorja, ki leži pred riboswitch stikalom. Za tem se nahaja TetR inverter, ki je sestavljen iz RBS-ja, kodirajoče regije represorskega proteina in terminatorja. Represor nadalje kontrolira promotor pod katerim leži regija za reporterski protein mRFP. Po vezavi liganda na območje riboswitch se sinteza represorskega proteina zmanjša, zato je inhibicija izražanja reporterskega proteina šibkejša ter tako njegova sinteza večja.
Sinteza toksina v dovolj visoki koncentraciji
Za uspešno uničenje parazita je potrebno zagotoviti, da se toksin izraža v zadostni količini, torej takrat, ko je število bakterij dovolj veliko. To omogoča mehanizem quorum sensing, preko katerega bakterije med seboj komunicirajo. Sistem je sestavljen iz genov LuxI in LuxR. LuxI kodira sintazo, ki sintetizira male molekule AHL (acil homoserin lakton). Te z difuzijo prehajajo čez celično membrano in predstavljajo signal za bakterije v okolju. AHL se veže na receptorski protein LuxR, ki preko pozitivne povratne zanke še dodatno aktivira izražanje LuxI. Kadar je število bakterij dovolj veliko, LuxR aktivira sintezo reporterskega proteina GFP.
Biološka varnost
Razširjanje gensko spremenjenih bakterij iz čebelnjaka in s tem možne škodljive učinke na okolje je potrebno preprečiti. Skupina je v ta namen pripravila toksin, ki je aktiven le v temnem okolju znotraj panja in se sintetizira samo v prisotnosti nenaravne aminokisline.
S svetlobo aktivirano smrtonosno stikalo
V temnem okolju znotraj panja so bakterije zmožne produciranja toksina. Če se zgodi, da bakterije uidejo v okolje, se aktivira od svetlobe odvisno smrtonosno stikalo, ki sproži smrt bakterij in prenehanje sproščanja toksina. Smrtonosno stikalo vključuje sočasno sintezo toksina in antitoksina. Ob izpostavljenosti svetlobi se razmerje med njima poruši v korist toksina, kar nato vodi v smrt bakterij. Testirali so dva različna sistema.
Prvo smrtonosno stikalo sestavljata dva sistema, in sicer promotorski sistem, ki se aktivira v prisotnosti svetlobe in sistem toksin-antitoksin. Promotorski sistem vsebuje histidinsko kinazo YF1, ki je občutljiva na modro svetlobo (470nm). YF1 v odsotnosti svetlobe fosforilira regulatorni protein FixJ in posledično aktivira promotor FixK2 pod katerim je zapis za antitoksin (MazE). V prisotnosti svetlobe je YF1 inaktiviran, zato se sinteza antitoksina zaustavi. V odsotnosti svetlobe se torej sintetizirata tako toksin (MazF) kot antitoksin, zato bakterija preživi. Ob izpostavljenosti svetlobi je sinteza antitoksina inhibirana, povečana količina toksina pa je za bakterije usodna.
Drugi sistem ima za FixJ2 promotorjem in pred genom za toksin vključen še represorski protein λ cI, ki deluje kot inverter. V odsotnosti svetlobe se represorski protein izraža in tako preprečuje sintezo toksina. V prisotnosti svetlobe pa je sinteza represorskega proteina inhibirana, zato se izražanje toksina močno poveča, kar vodi v celično smrt.
Toksin deluje kot endoribonukleaza, ki cepi mRNA in tako preprečuje transkripcijo genov, kar je za bakterijske celice usodno. Vloga antitoksina pa je zaviranje funkcije toksina. Ugotovili so, da drugi sistem deluje bolje.
Samouničenje s sistemom Cas9
V bakterijo so vključili tudi sistem samouničenja. Bakterije so oblikovali tako, da za preživetje nujno potrebujejo nenaravno aminokislino. Kadar te ni, bakterija s sistemom Cas9 sproži razgradnjo lastne DNA. Sistem Cas9 sestoji iz dveh delov. Prvi del predstavlja sintezo katalitično neaktivnega dCas9, drugi pa sintezo katalitično aktivnega Cas9. Oba v svojem zapisu vsebujeta TAG stop kodon in se sintetizirata, kadar bo na tRNA, ki prepozna TAG kodon vezana ustrezna aminokislina, kar bo omogočilo preskok stop kodona. Sinteza dCas9 bo potekla, kadar bo na tako tRNA vezana nenaravna aminokislina (BipA). Sinteza Cas9 pa bo potekla ob prisotnosti naravne aminokisline. Sistema so med seboj povezali tako, da sintetiziran dCas9 inhibira sintezo Cas9. Ko bakterija panj zapusti, nima več na voljo nenaravne aminokisline, zato se sinteza dCas9 zaustavi. Posledica je izražanje sistema Cas9, ki cepi bakterijsko DNA.
ZAKLJUČEK
Okužba čebel s parazitom Varroa Destructor predstavlja velik problem, saj imajo čebele na okolje in človeka pomemben vpliv. Žal popolnoma učinkovitih in varnih sredstev za boj proti parazitu še nimamo. Skupina podiplomskih študentov iz Univerzitetnega in raziskovalnega centra Wageningen na Nizozemskem je tekom iGEM projekta poskusila najti rešitev za množičen pogin okuženih čebel. V svojem projektu so se posvetili trem pomembnim področjem; specifičnost delovanja toksina, reguliranje produkcije toksina in omejevanje razširjanja bakterij v okolje. Pripravili so sistem gensko spremenjenih bakterij v obliki kontejnerja, ki bi ga čebelarji dodali v panj. Sistem je za uporabo enostaven in varen, predvsem pa učinkovit.
VIRI
- https://en.wikipedia.org/wiki/Varroa_destructor, dostopno: 22.11.2016
- http://2016.igem.org/Team:Wageningen_UR, dostopno: 24.11.2016
