InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov

Cambridge-JIC: InstaCHLAM - A Toolbox for Chloroplast Engineering, http://2016.igem.org/Team:Cambridge-JIC

Uvod

Mikroalge so enocelični organizmi veliki nekaj mikrometrov do nekaj sto mikrometrov in lahko rastejo posebej ali pa so združeni v verige. Iz znanstvenega vidika so zanimivi predvsem kloroplasti mikroalg, saj so ti tarča številnih raziskav, ki se osredotočajo na optimizacijo fiksacije ogljika in biosintezo lipidov za biogoriva. Mikroalge so zelo uporabne za gojenje zunaj laboratorijev, saj lahko rastejo v zelo različnih okoljih in so primerne za shranjevanje. Vse te lastnosti so razlog zakaj bi kloroplaste mikroalg lahko uporabljali za produkcijo cepiv. Te bi uporabili v razvijajočih se državah, kjer so klasična cepiva nedostopna. Zaradi velike evolucijske ohranitve genoma kloroplastov so raziskave na kloroplastih mikroalg uporabne kot model za ostale rastline. Hkrati pa je delo z mikroalgami enostavnejše kot delo z višjimi rastlinami.

Kloroplasti mikroalg so zanimivi tudi za proizvodnjo rekombinantnih proteinov, saj imajo zelo učinkovito izražanje proteinov. V kloroplastih so že uspešno izrazili številne proteine: monoklonska protitelesa, antigene, antitoksine in rastne faktorje. Kloroplasti imajo nekatere posttranslacijske modifikacije in vsebujejo šaperone in disulfid izomeraze, ki omogočijo pravilno zvijanje proteinov. V primerjavi z višjimi rastlinami, metabolna energija v mikroalgah ni usmerjena k ohranjanju kompleksne diferencialne strukture, kar še poveča izražanje transgenov. Delež teh izraženih genov lahko zavzema 30 – 50% suhe celične biomase.

Inženirstvo kloroplastov

Kljub številnim prednostim je inženirstvo kloroplastov trenutno slabo raziskovano. Razlogov za to je več. Prvi razlog je časovni, saj traja dva do tri mesece, da se doseže homoplazmija, ki je potrebna za analizo kolonij. Homoplazmija je stanje v katerem so vse kopije kloroplastne DNA enake. Drug razlog zakaj je to področje slabo raziskovano je cena. Kloroplaste lahko zanesljivo transformiramo samo z biolističnimi napravami, ki so komercialno zelo drage. Delo še dodatno otežuje pomanjkanje standardnih genetskih delov oziroma biokock.

Projekt

Zato se je ekipa iz Cambridge-JIC odločila, da bo v okviru iGEM tekmovanja razvila orodja za inženiring kloroplastov. Izbrali so si svoj modelni organizem Chlamydomonas reinhardtii. To je enocelična alga z enim kloroplastom in je primerna kot prototip za delo v rastlinah. V primerjavi z E. coli ali s kvasovko ima številne prednosti, saj Chlamydomonas ne potrebuje dodatnega vira ogljikovega atoma, kot je glukoza. Kar predstavlja veliko prednost na industrijski skali. Cilj njihovega projekta je bila odprava raznih problemov, ki se pojavljajo pri inženiringu kloroplastov. Projekt je sestavljen iz več delov.

• Sestavili so knjižnico biokock za uporabo v kloroplastih C. reinhardtii.
• Zgradili so gensko puško za cenejšo transformacijo kloroplastov.
• Zgradili so komoro za cenejše gojenje alg.
• Razvili so sistem z uporabo Cas9 s katerim bi dosegli hitrejšo homoplazmijo.
• Poleg tega so tudi modelirali dinamiko Cas9, da bi napovedali koliko časa bi potrebovali za transformacijo vseh kopij genoma kloroplastov.

Knjižnica biokock

Pripravili so številne biokocke, ki zapisujejo za razne promotorje, kodirajoča zaporedja, oznake itd. Pri vseh so izvedli optimizacijo kodonov za kloroplaste Chlamydomonas reinhardtii. Biokocke so testirali s kloniranjem v E. coli in v Chlamydomonas reinhardtii ter tudi s sekvenciranjem. Vse biokocke so kompatibilne z najnovejšimi standardni sestavljanja. Namen knjižnice pa je spodbuditi sestavljanje sintetičnih konstruktov v kloroplastih z uporabo novih biokock.

Genska puška

Zasnovali so nizkocenovno gensko puško. Biolistična metoda vnosa DNA je zelo uporabna pri rastlinskih celicah, saj prodira skozi rastlinsko celično steno in s tem omogoča tudi transformacijo kloroplastov. Metoda je precej učinkovita, problem predstavlja cena take naprave. Ekipa je zasnovala gensko puško, ki temelji na že obstoječih sistemih, vendar le za 1% njihove komercialne cene. Gensko puško so oblikovali tako, da uporablja nizko cenovne potrošne materiale, kot so CO2 naboji. Njihova genska puška vsebuje tudi varovalo za uporabnika, kar je velikokrat spregledan aspekt pri nekomercialnih napravah. Genska puška operira pri 140 psi, vse elektorske povezave so znotraj škatle in vse komponente so bile ločeno testirane za puščanje in električno varnost.

Komora za gojenje

Zgradili so tudi nizkocenovno in enostavno komoro za gojenje alg. Komora ima možnost optimizacije pogojev gojenja, ter dokumentacijo in analizo rasti na 90 mm petrijevkah. Prednost komore je njena cena, saj je ta zelo nizka v primerjavi s komercialno dostopnimi napravami. Komora je opremljena z 10 LED svetilkami v 5 različnih barvah, ki jih lahko programiramo v cirkadiarnem ritmu. Poleg tega komora vsebuje element za kontrolo temperature in kamero, ki avtomatsko slika vzorce na prej določen interval.

Sistem z uporabo Cas9 s katerim bi dosegli hitrejšo homoplazmijo

Glavni cilj projekta je bila zasnova sistema, ki temelji na tehnologiji CRISPR/Cas9 za pospešitev posttransformacijskega procesa in hitrega dosega homoplazmije. Pojem homoplazmija opisuje celice, ki vsebujejo enak genetski zapis v plazmidih. V primeru transformacije kloroplastov to pomeni, da se je transgen stabilno integriral v kloroplastni genom in da vse celice vsebujejo kloroplaste s transformirano DNA. Običajno se homoplazmijo doseže s ponavljajočo selekcijo na antibiotike. Celoten proces traja dva do tri mesece. Ekipa je razvila strategijo, kako bi ta čas signifikantno zmanjšali, idealno na en generacijski čas. To bi dosegli s kotransformacijo kloroplastov z dvema plazmidoma: gonilnim plazmidom in plazmidom z želeno kaseto. Za uporabo dveh plazmidov so se odločili zaradi preprečevanje širjenja proteina cas9. Na gonilnem plazmidu je zapis za protein cas9, zapis za rezistenco na antibiotik, zapis za gRNA in potrebne homologne regije, ki omogočajo homologno rekombinacijo v kloroplastni genom. Plazmid z želeno kaseto vsebuje gen, ki ga želimo vstaviti v genom kloroplasta, drugo rezistenco na antibiotik in drugačne homologne regije, kot so na gonilnem plazmidu. Vsi potrebni deli za sestavo teh dveh plazmidov so na voljo v prej omenjeni knjižnici biokock. Oba plazmida se integrirata v genom kloroplasta s homologno rekombinacijo, preko dveh setov homolognih regij. Ker imata plazmida različne rezistence na antibiotik bi dvojne transformante selekcionirali na ploščah, ki vsebujejo oba antibiotika.

Kloroplasti imajo običajno 80 kopij kloroplastnega genoma. Po transformaciji imamo še vedno veliko večino netransformiranih kopij kloroplastnega genoma. Lahko bi počakali, da se transformirane kopije genoma podvojijo, vendar lahko širjenje transformiranih kopij genoma pospešimo s tehnologijo Cas9. Ta inducira prelom dvojne vijačnice na izbranem mestu in sicer v homolognih regijah želene kasete. Ker je v kloroplastih edini možni način popravljanja homologna rekombinacija se želena kaseta uporabi kot matrica za ta proces. Na koncu bodo vse kopije kloroplastnega genoma vsebovale želeno kaseto in s tem bo dosežena homoplazmija. V tem procesu se gonilna kaseta z zapisom za Cas9 ne prenaša v kopije genoma, saj vsebuje druge homologne regije, kot je zaporedje preloma dvojne vijačnice.

Biološko širjenje genetskih modifikacij bi omejili z izgubo zapisa za Cas9. Predlagali so, da se po potrditvi homoplazmije, celice prenesene na plošče, ki vsebujejo le enega od antibiotikov. S tem bi odstranili selekcijski pritisk za ohranjanje gonilne kasete. Poleg tega je Cas9 rahlo toksičen v cianobakterijah, ki so najbližji predniki kloroplastov, kar bi še pospešilo izgubo Cas9. Ekipa ni prezrla tudi biološke varnosti. Gonilna kaseta ne more promovirati svojega lastnega podvajanja, saj Cas9 reže genom na drugih homolognih regijah. Kar pomeni, da transformirane alge ne bi predstavljale nevarnosti, tudi ob slučajnem sproščanju v okolje.

Na koncu postopka bi vse kopije genoma kloroplastov vsebovale le želeno kaseto. Poudarila pa bi, da ta sistem ni bil testiran in vivo. Poleg tega je bil sistem zasnovan za modelne organizme z enim samih kloroplastom in se morda ne bi mogel uporabiti pri višjih rastlinah.

Modeliranje dinamike sistema Cas9

Ukvarjali so se tudi z modeliranjem dinamike sistema Cas9, ki so si ga zamislili. Model razlaga notranje delovanje predlagane metode. Poleg tega ima pa tudi praktično vrednost, saj z njim določimo časovno skalo za homoplazmijo. Njihovi izračuni so pokazali, da naj bi dosegli homoplazmijo v sedmih urah in petih minutah. Kar je manj, kot delitveni čas C. reinhardtii. To pomeni, da bi z njihovim sistemom dosegli homoplazmijo v eni generaciji.

Zaključek

Ekipa iz Cambridge-JIC se je na letošnjem iGEM tekmovanju ukvarjala z odprava raznih problemov, ki se pojavljajo pri inženiringu kloroplastov. Svoj projekt so zastavili zelo široko, saj so sestavili knjižnico biokock, zgradili gensko puško in komoro za gojenje, razvili sistem s katerim bi dosegli hitrejšo homoplazmijo, ter modelirali dinamiko Cas9. Za svoje delo so si prislužili zlato nagrado na področju rastlinske sintetične biologije. Edina pomanjkljivost njihovega projekta je, da niso testirali glavni del projekta in vivo.

Viri

1. iGEM 2016: InstaCHLAM - A Toolbox for Chloroplast Engineering, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:Cambridge-JIC