Mos(kit)o
Pasteur Paris 2016: Mos(KIT)o - Naprava na osnovi biosilicijevega dioksida za odkrivanje komarjev, ki so okuženi z arbovirusi http://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris
Uvod
Bolezni, ki jih prenašajo nekateri vektorji, so odgovorni za različne epidemije po svetu. V večini primerov proti tem boleznim na voljo nimamo cepiv, najboljši nadzor širjenja vektorjev pa so insekticidi. Prevelika raba insekticidov je breme za okolje, kot tudi vodi v rezistenco insektov, kar pa bi lahko preprečili z diagnostično napravo skupine Pasteur iz Pariza, ki so jo poimenovali Mos(KIT)o. S testom bi skoraj v realnem času dobili podatke, kje na svetu so komarji okuženi in tako bolj specifično uporabili insekticide ter lažje in bolje izvedli preventivne ukrepe. Osredotočili so se na komarje in na arboviruse, ki jih prenašajo.
Mos(KIT)o
Glavni del projekta je razvoj ploščice za detekcijo okuženih komarjev, ki prestavlja le enega izmed treh delov sistema. Celoten sistem je sestavljen iz pasti za komarje, testa za analizo okuženih komarjev oz. analizne ploščice in podatkovne baze. Pri razvoju vseh treh delov so težili k temu, da bi bila uporaba testa za uporabnika enostavna in varna. Hkrati je možno izvesti test za 4 različne okužbe. Da je naprava varna kot je le mogoče, so vse tekočine, ki so potrebne za izvedbo testa, shranjene na koncu črpalke, kjer absobent spremeni tekočino v gel, ki ga lahko varno odvržemo v koš in zamenjamo z novim.
Past za komarje
Past, ki so jo razvili skupaj s strokovnjaki za žuželke (entomologi), je namenjena lovljenju izključno komarjev. Komarje privabi človeški feromon in stoječa voda v pasti, kar so poimenovali filter komarjev. Na filtru najdemo tudi QR kodo, ki nam ob skeniranju, avtomatsko zabeleži dan postavitve vabe in njeno GPS lokacijo. Feromonska vrečka se ni izkazala za najbolj učinkovito vabo, zato bi jo v prihodnosti najverjetneje zamenjali z generatorjem CO2.
Test za analizo okuženih komarjev
Analizna ploščica je sestavljena iz treh plasti: spodnje plasti iz celuloze in silicijevega dioksida, ki služi kot nosilec; vmesne, proteinske plasti in vrhnje plasti, ki omogoča detekcijo. Ploščice so naredili tako, da so združili vse tri plasti skupaj. Mešanico celuloze in silikatnega gela ter fuzijskega proteina s kondenziranim silicijevim dioksidom so s posebno napravo stisnili v tanko plast. Nato so površino prekrili s specifičnimi protitelesi.
Plast iz celuloze in silicijevega dioksida
Celuloza je kot nosilec primerna zato, ker ne moti imunoloških reakcij. Uporabili so komercialno celulozo.
Proteinska plast
Naredili so fuzijski protein v katerem so združili tri proteine s tremi različnimi funkcijami. Fuzijski protein se veže na celulozno plast in jo ojača s kondenzacijo silicijevega dioksida, prav tako pa veže specifična protitelesa. Fuzirali so vezavni protein, ki veže silicijev dioksid (Si4), B domeno stafilokoknega proteina A (BpA) in vezavni protein A, ki se veže na celulozo (CBPa). Pomembno je, da Si4 in BpA prostorsko nista preveč blizu, saj bi silicijev dioksid, ob vezavi na Si4, lahko prekril protitelo vezano na BpA, zato so med njiju dali protein CBPa. Končni produkt je fuzijski protein Si4-CBPa-BpA, ki so ga poimenovali protein C in ima 25kDa.
Fuzijski protein so naredili s pomočjo že obstoječih biokock, ki so jih naredile pretekle iGEM skupine. Združili so biokocke BBa_K1028000, ki vsebuje zapis za Si4; BBa_K863110 z zapisom za CBPa in BBa_K103003, ki nosi zapis za BpA . Da so ohranili konformacijo fuziranih proteinov in njihovo aktivnost, so jih med seboj ločili s fleksibilnim linkerjem.
Za lažje čiščenje proteinov so na 5' konec dodali sekvenco za HisTag, pred njim pa so dodali še mesto za cepitev s TEV proteazo, s katerim je možna odstranitev HisTag-a. Z dodatkom začetnega kodona ATG in TAA stop kodona so zagotovili, da se je protein res izražal. Iz pET43.1a vektorja so dodali tudi cis regulatorne sekvence (T7 terminator in T7 promotor) ter na koncu tudi restrikcijski mesti BamI in HindIII. Naredili so dve različici proteina C1 in C2, ki sta se razlikovala v tem ali je HisTag na C ali N-terminalnem koncu. Zaporedje za fuzijski protein so sintetizirali pri podjetju Integrated DNA Technology.
Sintetizirana zaporedja so pomnožili z PCR reakcijo in jih klonirali v TOPO vektorje, da bi namnožili plazmide. S TOPO plazmidi z vstavljenimi inserti so transformirali kompetentne TOP 10 celice E. coli s toplotnim šokom. Bakterije so dali na LB gojišča, kjer so celice selekcionirali z ampicilinom (bakterije, ki so sprejele TOPO vektor so preživele, saj je na vektorju zapis za rezistenco na antibiotik) in z X-gal. Bele kolonije so predstavljale bakterije, ki so sprejele rekombinantni vektor. Ko so se bakterije dovolj namnožile, so iz njih izolirali plazmid in z restriktazama Xba/HindII in z elektroforezo preverili ali plazmidi res vsebujejo kloniran insert. Insert so izolirali iz gela in ga ligirali v defosforiliran ekspresijski vektor pET43.1a. Ponovili so postopek s katerim so dokazali prisotnost inserta v ekspresijskem vektorju z elektroforezo . S sekvenciranjem so potrdili pravo zaporedje vektorja. Za produkcijo večjih količin proteina C so transformirali BL21(DE3), bakterije E. coli, s pripravljenim rekombinantim plazmidom. Ko so bile bakterije dovolj goste so inducirali ekspresijo proteina z dodatkom izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) in z gojenjem celic pri temperaturi 15°C čez noč. Zagotoviti so morali, da se protein ni konstitutivno izražal, saj niso vedeli kakšen vpliv ima na bakterijski metabolizem. Proteine so očistili s hitro tekočinsko kromatografijo pod pritiskom (FPLC) z uporabo polistirenske kolone zaradi intrinzične afinitete proteina C do celuloze. Protein so eluirali s pufrom, ki je vseboval imadazol, detektirali pa so dva vrhova. S SDS-PAGE so ugotovili , da vrhova ustrezata proteinom velikosti 25kDa in 50kDa in da je verjetno nekaj proteina v dimerni obliki. Z masno spektrometrijo in prenosom Western, kjer so uporabili protitelesa proti HisTag oznaki, so se prepričali, da so res izolirali protein C.
Imunodetekcija
Naloga te plasti je zaznati prisotnost antigenov patogenov s specifičnimi protitelesi vezanimi na fuzijski protein. Metoda detekcije temelji na konjugaciji antigena s hrenovo peroksidazo in vezavo teh antigenov s specifičnimi protitelesi, ki so vezani na fuzijski protein oz. na komercialno membrano. Po dodatku substrata za hrenovo peroksidazo vidimo rjavo obarvanje, ki potrdi prisotnost antigena v preiskovanem vzorcu. Ker celoten test za analizo ni bil popolnoma dokončan, so uspešnost detekcije preizkusili na komercialni membrani. Uporabili so en sam očiščen protein virusa rumene mrzlice (YFVp). Prekrito membrano s protitelesi proti YFVv so inkubirali s hrenovo peroksidazo (HRP) konjugiranim govejim serumskim aluminom (BSA), samo YFVp in HRP-YFVp. Pozitiven in tudi edini logični rezultat so dobili samo pri HRP-YFVp. Preverili so tudi, ali sami proteini iz lizata neokuženih komarjev lahko motijo interakcijo med virusnimi proteini in specifičnimi protitelesi. Test so izvedli na membranah, kot tudi na testni ploščici. Uporabili so protitelesa proti činkunguja virusu(CHIKV) in konjugiranim proteinom CHIKV s HRP. Test na membranah je sicer pokazal nekaj nespecifičnosti, vendar pa je jasno viden večji signal ob prisotnosti proteina CHIKV. Njihova testna ploščica ni dala najboljših rezultatov, saj je bila specifičnost prenizka, kar so pripisali omejenemu spiranju ploščice, saj je bila ta zelo krhka in so se z njo morali pazljivo rokovati.
Funkcijski testi proteina C
Izvedli so tudi funkcijske teste fuzijskega proteina.
Najprej so testirali sposobnost proteina, da se veže na celulozo. Celulozo so zmešali z BSA-jem, enkrat brez in drugič s proteinom C, tako da sta oba proteina tekmovala za vezavo s celulozo. Po spiranju in centrifugiranju so analizirali proteine v supernatantu in peletu s SDS-PAGE. Ugotovili so, da so se proteini velikosti 25kDa in 50 kDa vezali na celulozo, BSA pa ne. Po drugem spiranju večino proteina C najdemo v peletu. Vseeno pa ga je nekaj ostalo v supernatantu, kar so pripisali preveliki začetni koncentraciji proteina C in posledično zasičenju mest za vezavo.
Drugi test je bil test biosilifikacije, kjer so preizkusili funkcijo Si4. Uporabili so tetraetil ortosilikat (TEOS) kot vir silicijeve kisline. V kislih pogojih se iz TEOS-a sprosti silicijeva kislina, ki jo protein C uporabi za silifikacijo. Spektrofotometrično so določili količino proste silicijeve kisline z mobildenovim testom. Na začektu je bila koncentracija proste silicijeve kisline 206 µg/ml, po 2h reakcije pa 33µg. Zaključili so lahko, da njihov protein deluje.
Za testiranje funkcije BpA jim je zmanjkalo časa.
Podatkovna baza
Rezultate se po končani analizi vnese v podatkovno bazo in tako posodobimo zemljevid, ki nam pokaže, kje se nahajajo okuženi komarji, v skoraj realnem času. Razvili so tudi prototip strani http://moskit.esy.es in aplikacijo.
Testirali so tudi mehanske lastnosti njihove analizne ploščice za katero so ugotovili, da so glede na nekatere teste, primerljive z rigidnostjo plastike. Poleg opisane ploščice za analizo so študenti sami oblikovali in izdelali past za komarje, napravo za izvedbo analize, razvili pa so tudi aplikacijo in spletno stran, kjer je možno dostopati do podatkov o lokaciji okuženih komarjev. S 3D modeliranjem so oblikovali posamične dele, ki so jih sprintali s 3D tiskalnikom, izdali pa so tudi priročnik o intelektualni lastnini za iGEM skupine.
Viri
2016.igem.org. (2016). Team:Pasteur Paris - 2016.igem.org. [online] Dostopno na: http://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris [Datum ogleda 5.12.2016].
